一、胰腺癌肝转移体外模型的构建（论文文献综述）
贾修娜[1]（2021）在《多模态成像指导的协同治疗胰腺癌的多功能诊疗纳米材料的合成与应用》文中研究表明近年来,基于纳米材料的胰腺癌治疗得到了广泛关注和迅速发展。主要挑战包括:诊断和治疗结合差、难以根治、抗肿瘤疗效不理想和转移复发风险大等。另外,利用肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）缺氧、微酸性和高过氧化氢（H2O2）等特点,开发简单有效的策略来构建具有TME刺激响应的多功能纳米平台展现出较大的优势。研究表明,纳米诊疗剂的成像及治疗效果受组成、电荷及形貌粒径等的影响较大。在本论文中,设计合成了三种具有多功能刺激响应特性的纳米材料,并将其用于高效载药、成像诊疗以及体内外抗肿瘤。尤其,我们着眼于构建多模态成像引导的光热治疗协同基因治疗或者光热治疗协同光动力治疗于一体的多功能纳米平台,优化纳米诊疗试剂的性能以提高其协同诊疗效果。主要研究内容如下:1.本研究将带正电荷的脂质双层膜（DODAB/DOPE）包覆在还原氧化石墨烯@金纳米星（rGO@AuNS）上,制备基因/光热协同治疗剂rGO@AuNS-DODAB/DOPE。此外,rGO@AuNS-DODAB/DOPE表面交联叶酸（FA）分子,可特异识别表面高表达叶酸受体（FR）的癌细胞,通过受体介导的内吞作用极大地提高纳米材料的靶向能力和光声及光热成像诊断性能。此外,光热与基因（靶向G12V突变的K-Ras基因）协同治疗对荷载胰腺癌Capan-1肿瘤的小鼠具有显着的抗肿瘤效果,值得一提的是,治疗组具有优异的抗肝转移作用。2.抗坏血酸做还原剂,以普鲁士蓝类似物为种子,一步法简单快速地合成了脂质体包覆的类普鲁士蓝@金纳米花多功能载体（Lipo-PBA-Au）,然后在脂质体表面修饰具有靶向能力的RGD肽,制备带有正电荷的Lipo-PBA-Au-RGD（LPBGD）纳米基因载体。LPBGD可携带siRNA靶向进入表面高表达αvβ3整合素受体的胰腺癌细胞,当给予808 nm激光照射,材料将光能转换为热能时,一方面启动光热治疗,另一方面由于温度高于材料的中磷脂的相变温度,导致磷脂的相态变化,释放更多的siRNA。最终,通过基因协同光热治疗,更高效率的杀死肿瘤细胞并抑制肿瘤的复发。此外,LPBGD具有优异的光声、CT和光热成像能力,可同时用于活体内的癌症诊断。3.在室温下超快速合成了一种单宁酸（TA）与Fe3+络合物包覆的上转换纳米材料UCNP@TA/Fe,纳米材料的负电性增强了其对光敏剂的负载能力,Fe3+的掺杂使材料具有类过氧化氢酶的性质,对癌细胞中的H2O2表现出优异的催化性能,使其在肿瘤部位生成O2,从而克服肿瘤缺氧,进而提高光动力治疗效果。此外,通过酰胺化反应及迈克尔加成反应将线粒体靶向分子4-羧丁基三苯基溴化膦（TPP）以及能高度亲和整合素受体αvβ3的RGD肽连接到UCNP@TA/Fe材料表面,促进更多的携带光敏剂PC4的纳米材料进入到ROS敏感的细胞器线粒体中,最后,仅通过808 nm单一波长的激光就同时实现了胰腺癌的PTT与PDT协同治疗。此外,该纳米材料可以作为多模态成像诊断试剂,通过光声（PA）,核磁共振（MR）,光热（PT）和上转换（UCL）成像手段指导乏氧胰腺癌的光热和光动力协同治疗,并取得满意了的疗效。
唐健[2]（2021）在《长链非编码RNA PTTG3P在胰腺癌细胞生长与转移中的作用及机制研究》文中研究表明胰腺癌恶性程度高,预后极差,5年生存率不足5%,90%的患者生存期不超过一年。在中国,胰腺癌的致死率排在第六位,而且年轻患者的比例在逐年增高。侵袭和转移是胰腺癌的特点,临床上大多数病人都会出现周围组织器官的侵犯以及远处转移。胰腺癌的早期诊断困难加之缺少良好的预后判断指标,对于该疾病的早期及复发性阶段的干预治疗常常不及时,而且胰腺癌的化疗耐药问题也比较突出。深入探索胰腺癌的发病机制,对寻求胰腺癌有效的诊断和判断预后的分子指标具有非常关键的科学价值和现实意义。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,其在肿瘤的发生发展中起着重要的作用,能够调节肿瘤细胞内部的多种生物过程,涉及转录、转录后和表观遗传水平上的相关通路。而且,越来越多的研究证明lncRNAs在胰腺癌发生发展过程中也发挥着关键作用。PTTG3P（Pituitary tumor-transforming 3,pseudogene,垂体瘤转化因子3假基因）是与亲本基因PTTG1、PTTG2具有高度相似性序列的假基因。作为一个lncRNA,PTTG3P在多种肿瘤疾病中高表达并且发挥着重要的致癌作用,相关机制研究也证明PTTG3P可以通过多种机制促进肿瘤细胞的恶性表型。在本课题中,我们力图揭示PTTG3P在胰腺癌发生发展中的具体作用以及临床意义,并对PTTG3P在胰腺癌肿瘤细胞中的具体致癌分子通路以及表达调控网络进行分析。我们发现PTTG3P在胰腺癌肿瘤组织中显着上调,且PTTG3P的表达水平与胰腺癌肿瘤的大小和肿瘤的分化程度密切相关。同时,肿瘤组织中PTTG3P高表达的患者总体生存期也明显缩短。生物信息学和细胞生物学实验证明PTTG3P可以通过FoxM1信号通路促进胰腺癌细胞的生长和转移。进一步研究发现PTTG3P可以作为ceRNA竞争性结合miR-132/212-3p调控FoxM1的表达进而发挥促癌功能,而且FoxM1可以转录激活PTTG3P形成一个促进胰腺癌发展的正反馈回路。通过以上内容,我们旨在探讨PTTG3P在胰腺癌疾病中的临床意义以及细胞生物学中的具体靶向机制,为胰腺癌的诊断和治疗提供新的潜在靶点。第一部分:LncRNAPTTG3P在胰腺癌中的表达及临床意义目的:分析PTTG3P在胰腺癌中的表达水平及其与临床病理和预后的关系。方法:通过对胰腺癌组织芯片（25例）的原位杂交染色和60对临床标本的实时荧光定量PCR检测,比较胰腺癌肿瘤组织和癌旁组织中PTTG3P的表达差异。进一步统计分析60例临床患者肿瘤组织中的PTTG3P表达量和胰腺癌患者临床病理特征参数以及预后的相关性。结果:原位杂交染色和实时荧光定量PCR检测结果一致证明PTTG3P在胰腺癌肿瘤组织中的表达量相对于癌旁组织中的表达量显着上调。胰腺癌患者肿瘤组织PTTG3P的表达量与临床病理特征参数统计分析结果显示PTTG3P的表达与胰腺癌肿瘤大小和病理分级密切相关。对肿瘤组织PTTG3P表达水平与患者总体生存率进行相关性分析,我们发现PTTG3P高表达组的生存期显着短于PTTG3P低表达组。结论:PTTG3P在胰腺癌肿瘤组织中表达显着升高;PTTG3P表达水平与胰腺癌肿瘤大小和肿瘤细胞分化程度密切相关;PTTG3P高表达的患者总体生存期明显降低。第二部分:LncRNA PTTG3P对胰腺癌细胞生物学行为的影响目的:探讨PTTG3P在胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。方法:通过实时荧光定量PCR检测PTTG3P在正常胰腺导管上皮细胞和不同胰腺癌细胞系中的相对表达水平。在内源性表达PTTG3P含量较低的胰腺癌细胞系中过表达PTTG3P,在内源性表达PTTG3P含量较高的胰腺癌细胞系中敲减PTTG3P。通过CCK-8实验、平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell小室迁移实验和侵袭实验体外观察PTTG3P对胰腺癌细胞恶性表型的影响。通过裸鼠体内皮下或回结肠静脉接种胰腺癌细胞,观察PTTG3P对胰腺癌肿瘤生长以及肝转移的影响。结果:PTTG3P在胰腺癌细胞中的表达水平要明显高于正常的胰腺导管上皮细胞。CCK-8生长曲线实验和平板克隆形成实验表明PTTG3P过表达细胞株的增殖能力明显增强,而PTTG3P下调的细胞株增殖能力明显减弱。细胞划痕实验和Transwell小室迁移实验结果表明PTTG3P能够促进胰腺癌细胞的迁移。Transwell侵袭实验进一步说明PTTG3P在胰腺癌细胞的侵袭性表型中发挥重要的促进作用。皮下成瘤实验说明PTTG3P在体内可以促进胰腺癌肿瘤的生长。肝转移模型中上调PTTG3P组的肝脏转移灶数目明显多余对照组,而下调PTTG3P组的结果正好相反。结论:PTTG3P在胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力上发挥着重要的促进作用。第三部分:LncRNA PTTG3P/miR-132/212-3p/FoxM1调控胰腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的分子机制研究目的:探索PTTG3P在胰腺癌细胞恶性表型中发挥促进作用的具体分子机制。方法:利用LinkedOmics数据库分析和PTTG3P相关的mRNAs,并通过TCGA数据库以及临床病理标本检测验证FoxM1和PTTG3P的相关性。通过Western-blot和实时荧光定量PCR分析PTTG3P对FoxM1表达调控的作用。通过细胞学实验分析作为下游的FoxM1在PTTG3P促癌中的作用。再利用生物信息学和核浆分离实验分析PTTG3P在胰腺癌细胞中的定位,通过Dicer蛋白的干预实验和Ago2-RIP实验预测PTTG3P调控FoxM1是否通过ceRNA机制。利用生物信息学和Ago2-RIP实验对ceRNA机制中可能的miRNAs进行筛选。通过构建突变基因质粒、荧光素酶报告基因实验以及MS2-RIP实验,明确miRNA与PTTG3P和FoxM1的具体结合位点,以及通过Western blot和实时荧光PCR在细胞实验和皮下瘤实验中验证三者间表达调控关系。结果:通过生物信息学分析,在与PTTG3P相关mRNAs的共同表达网络中,我们发现在胰腺癌发生发展中具有多种调控作用的促癌基因FoxMl。对TCGA数据以及临床标本检测结果进行分析,结果一致表明FoxM1和PTTG3P在胰腺癌中是高度正相关的。在胰腺癌细胞中,PTTG3P可以在mRNA水平和蛋白水平上同时促进FoxM1基因的表达。CCK-8、细胞划痕和Transwell侵袭实验表明下调FoxM1会明显抑制PTTG3P对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用;相反,过表达FoxM1会明显降低因下调PTTG3P所产生的抑癌作用。亚细胞定位分析发现PTTG3P主要位于胰腺癌细胞质中。在胰腺癌细胞中下调Dicer蛋白,发现PTTG3P上调FoxM1的过程被阻止;在Ago2-RIP实验中,发现PTTG3P与Ago2有明显的结合,证明PTTG3P可能作为一个ceRNA参与调控FoxM1。通过miRcode、Targetscan生物信息学数据库的预测和Ago2-RIP实验的筛选,我们发现miR-132/212-3p可能介导PTTG3P对FoxM1的调控作用。进一步构建野生型和突变型质粒,通过双荧光素酶报告基因实验和MS2-RIP实验,我们确认了 miR-132-3p和miR-212-3p分别与PTTG3P和FoxM1靶向结合的位点,并且PTTG3P可以通过miR-132/212-3p调控FoxM1。通过实时荧光定量PCR和Western blot实验,在mRNA水平和蛋白水平上再次确认,在miR-132/212-3p抑制剂存在下,下调PTTG3P所引起的FoxM1的表达抑制将被显着减弱。通过实时荧光定量PCR检测裸鼠体内成瘤实验中所形成的胰腺癌组织,我们发现PTTG3P促进肿瘤生长与miR-132/212-3p和FoxM1的表达密切相关,并且结果与上述细胞实验一致。结论:PTTG3P对胰腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的促进作用至少部分通过FoxM1介导的,同时PTTG3P可以作为ceRNA通过竞争性结合miR-132/212-3p调控FoxM1的表达。第四部分:FoxM1转录调控lncRNA PTTG3P在胰腺癌细胞中的表达目的:探讨PTTG3P在胰腺癌细胞中异常表达的上游调控机制,验证FoxM1对PTTG3P表达水平的影响,分析FoxM1调控PTTG3P的具体分子机制。方法:通过生物信息学分析PTTG3P的启动子序列,寻找其上游可能存在的转录调控因子。在胰腺癌细胞系中转染FoxM1过表达质粒或siRNA,采用实时荧光定量PCR检测PTTG3P的表达变化。根据PTTG3P启动子上FoxM1的潜在结合位点的位置构建报告基因质粒,利用双荧光素酶报告基因实验分析FoxM1转录激活PTTG3P表达的具体结合位点,并通过染色体免疫共沉淀实验进一步验证FoxM1与PTTG3P的靶向作用位点。结果:分析PTTG3P的启动子序列,发现有FoxM1蛋白的结合位点,提示FoxM1可能存在转录调控PTTG3P的作用。在胰腺癌细胞中过表达FoxM1后PTTG3P表达水平显着上调,而干扰FoxM1后PTTG3P表达水平显着下调。通过双荧光素酶报告基因实验和ChIP-qPCR实验,我们发现FoxM1可以靶向识别PTTG3P启动子区域TFBS1进而通过转录激活作用调节PTTG3P的表达。结论:FoxM1转录激活PTTG3P的表达。
李桐[3]（2021）在《胰腺癌肿瘤免疫微环境预后模型的构建和潜在治疗靶点的研究》文中提出研究背景胰腺癌起病隐匿,发展迅速,是预后最差的消化道恶性肿瘤,其高度侵袭、转移的特性以及对化疗的不敏感性,使其整体5年生存率仍不到1 0%。胰腺癌的肿瘤微环境（tumor micro-environment,TME）十分特殊,表现为大量免疫细胞浸润,而癌细胞所占比例不足30%。近年研究表明,以TME为靶点可有效提高胰腺癌化疗的有效率,这也成为目前国内外研究的热点。但迄今为止,人们尚未在TME中构建出与胰腺癌患者预后相关的多因子调控网络,故通过大数据挖掘和肿瘤基因组图谱（the Cancer Genome Atlas,TCGA）建立TME中多因子调控网络可帮助指导胰腺癌的个体化治疗及提高预后。另一方面,已知肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）在胰腺癌TME的免疫浸润细胞中所占比例最大,而在胰腺癌的进展及化疗耐药中起到至关重要的作用,结合本课题组在TAM领域所作前期研究及铺垫,对吉西他滨化疗刺激的胰腺癌细胞与M2型TAM共培养的胰腺癌细胞共同进行蛋白质质谱分析,结果发现胰腺癌细胞可能通过吉西他滨及TME中肿瘤相关巨噬细胞的刺激分泌干扰素刺激蛋白20（interferon-stimulated gene of 20 kDa protein,ISG20）,从而对胰腺癌的发生发展起促进作用。目前已报道ISG20在多种肿瘤及免疫反应中发挥重要作用,但未见其与胰腺癌发生发展及化疗耐药方面的研究工作。因此本论文在对胰腺癌TME,尤其是免疫细胞及因子调控与胰腺癌预后进行生物信息学的综合分析外,并同时进行已知的相关蛋白ISG20与胰腺癌细胞的生物学行为的关系及指导临床意义的研究。研究目的构建胰腺癌免疫微环境中与预后相关的多因子调控网络进而挖掘对胰腺癌患者预后有价值的调控分子。探索TME中潜在治疗靶点ISG20对胰腺癌细胞增殖、侵袭转移、化疗耐药等恶性生物学行为的调控作用,以及其下游调控的信号通路,明确ISG20在胰腺癌组织中的表达水平及其诊断和预后价值。研究方法一、胰腺癌免疫微环境中与预后相关的多因子调控网络模型的构建利用Kaplan-Meier法进行生存分析;用Limma包进行差异分析,并通过显着性筛选得到差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）;用 KOBAS 数据库对DEGs进行通路富集分析;用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质互作网络;并进行富集分析;用Cytoscape软件对基因网络中的关键基因进行筛选和模块挖掘及网络拓扑关系分析。二、胰腺癌肿瘤免疫微环境中潜在治疗靶点ISG20的作用及机制研究1.利用细胞增殖实验、Transwell、细胞毒性实验测定胰腺癌细胞的生物学行为;2.利用RNA-seq等方法筛选ISG20下游靶点;3.利用免疫组化染色,对胰腺癌中ISG20的表达与患者临床病理特征之间的关系及其预后价值进行分析评估。研究结果一、胰腺癌免疫微环境中与预后相关的多因子调控网络模型的构建1.TCGA数据库的胰腺癌队列中,免疫评分Ⅱ期>Ⅲ/Ⅳ期>Ⅰ期;2.免疫评分低的胰腺癌患者比高免疫评分的患者相比,5年生存率显着更长;3.模块挖掘得到的与胰腺癌及其他肿瘤预后相关的基因包括:CXCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11、PPY、LPAR3、HCAR3、ANXA1、SSTR1、SSTR5、INSL5、CCL28、KISS1R 以及 P2RY2;4.对胰腺癌预后相关基因具有显着调控作用的非编码RNA-pivot节点包括:WSPAR、hsa-miR-4425、hsa-miR-4536-5p、hsa-miR-410-5p、hsa-miR-8064、hsa-miR-6871-5p、hsa-miR-4767、hsa-miR-608、hsa-miR-4481 以及 hsa-miR-3605-3p;5.对胰腺癌预后相关基因具有显着调控作用的转录因子-pivot节点包括:RFWD2、GATA6、CITED2、PER2、TGIF1、RARA 以及 NR5A1;6.对胰腺癌具有潜在治疗效果的药物-pivot节点包括:Fibrinolysin、Urokinase、Pasireotide、Octreotide、Lutetium Lu 177 dotatate、Tenecteplase、Amcinonide、Botulinum Toxin Type A、HspE7 以及 Lanreotide。二、胰腺癌肿瘤免疫微环境中潜在治疗靶点ISG20的作用及机制研究1.ISG20对胰腺癌恶性生物学行为的调控ISG20可显着促进胰腺癌细胞体外及体内的侵袭转移能力,并降低胰腺癌细胞对吉西他滨化疗药的敏感性,但不影响胰腺癌细胞的体外增殖能力。2.ISG20对胰腺癌恶性生物学行为调控的分子机制研究通过筛选得到α3整合素（integrin alpha 3,ITGA3）分子,在进行瞬时敲减后,发现 β1 整合素（integrin beta 1,ITGB1）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）及其第185位点的酪氨酸磷酸化水平均显着降低,而平衡型核苷转运载体-1（equilibrative nucleoside transporter 1,ENT1）表达水平显着升高。3.ISG20在胰腺癌组织中的预后价值ISG20的表达水平与患者的预后相关,ISG20高表达患者的总体生存期显着短于低表达者。研究结论一、胰腺癌免疫微环境中与预后相关的多因子调控网络模型的构建1.构建了胰腺癌免疫微环境核心预后相关因子网络,包括与胰腺癌预后相关的DEGs、对预后相关基因具显着调控作用的非编码RNA、转录因子及具潜在治疗效果的药物;2.本研究基于大数据挖掘的预后相关因子不仅可在胰腺癌的发生发展过程中起重要作用,还有助于改善胰腺癌治疗和评估患者预后、早期诊断和个体化治疗。二、胰腺癌肿瘤免疫微环境中潜在治疗靶点ISG20的作用及机制研究1.ISG20可显着促进胰腺癌细胞的侵袭转移能力以及对吉西他滨化疗耐药能力;2.ISG20通过激活α3β1-JNK-ENTI发挥作用;3.ISG20高表达预示不良预后,可作为潜在的治疗靶点。
李军[4]（2021）在《结直肠癌和食管癌标志分子RAD23B和TSP-1的验证、功能研究和检测体系的建立》文中指出消化道肿瘤是我国常见的肿瘤,消化道肿瘤的新发病例数和死亡病例数约占我国肿瘤总的新发病例数和死亡病例数的一半,结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）和食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）的新发病例数和死亡病例数都排在前五名。目前临床上用于消化道肿瘤标志物共同的特点是敏感度低,不适合用于消化道肿瘤的筛查和早期诊断,导致消化道肿瘤就诊是已为中晚期,因此寻找新的消化道肿瘤标志物是摆在肿瘤学科学家面前一个亟待解决的科学问题。本研究首先利用CRC组织芯片和斑点杂交（Dot blot）技术对CRC患者癌组织和CRC患者尿液的UV切割修复蛋白RAD23同源物B（Human homologue of yeast UV excision repair protein,RAD23B）表达水平进行分析,发现与癌旁相比CRC患者的RAD23B水平明显增高,CRC组织细胞浆RAD23B水平增高与CRC的病理分级,AJCC分期和肝转移有关,Kapan-Meier生存分析显示,CRC胞浆RAD23B水平增高与CRC患者总生存期（OS）缩短有关。Dot blot定量分析CRC患者尿液中RAD23B水平显示,相比于健康对照CRC患者尿液RAD23B水平明显升高,并且与结直肠癌肝转移相关。受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析显示,CRC患者尿液RAD23B对CRC和肝转移性CRC诊断的ROC曲线下面积分别为0.623和0.637。提示RAD23B与是一个潜在的CRC肝转移的标志物。接下来研究了 RAD23B在CRC发生和发展中的生物学功能。首先,在体外利用分子生物学技术敲降结直肠癌SW480和HCT8细胞中RAD23B的水平,发现结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力在沉默RAD23B的表达后被抑制。小鼠体内实验也发现,沉默RAD23B的表达抑制结直肠癌细胞的增殖和肝转移。然后,利用RNA-seq技术探究RAD23B调控结直肠转移能力的机制,发现抑制结直肠癌RAD23B的表达后Integrin信号通路被抑制,Western blot进一步证实Talin1/2/integrin/FAK/RhoA信号通路被明显抑制。进一步我们采用IP-MS技术分析了与RAD23B相互作用的分子,发现RAD23B与冠蛋白3（Coronin 3,CORO1C）存在相互作用。进一步实验证实RAD23B与CORO1C存在相互作用和共定位。过表达RAD23B能够促进CORO1C和RAC1、Cortactin共定位于细胞边缘,促进肿瘤细胞伪足生成,抑制RAD23B表达则抑制CORO1C向肿瘤细胞边缘聚集。因此,我们提出 RAD23B 可能通过 Talin1/2/integrin/FAK/RhoA/RAC 1/CORO1C 轴调控结直肠癌细胞侵袭、转移。本实验室前期通过多肽组学技术发现,血小板反应蛋白-1（Thrombospondin-1,TSP-1）肽段在食管患者血浆中表达明显增高,是一个潜在的ESCC早期标志物。TSP-1属于血小板凝血蛋白家族,生物学功能多样,具有调控细胞粘附、迁移、增殖和血管生成等作用。在肿瘤中,TSP-1依肿瘤的不同而发挥着不同作用,或促进肿瘤的进展,或抑制肿瘤的进展。本研究采用杂交瘤技术,制备了血小板反应蛋白-1（TSP-1）肽段N端和C端的单克隆抗体,建立了血浆TSP-1的化学发光检测体系并初步验证。初步验证结果显示血浆TSP-1随着食管不典型增生的进展,表达水平逐渐增高,当食管病变发展到食管癌阶段血浆TSP-1水平降低,但相比于健康对照血浆TSP-1水平依然明显增高。血浆TSP-1对食管不典型增生诊断的ROC曲线下面积达0.938,对ESCC诊断的ROC曲线下面积为0.66,提示血浆TSP-1可以作为ESCC筛查的标志物。
刘淞淞[5]（2020）在《LncRNA RUNX1-IT1经RUNX1促进胰腺癌进展的机制研究》文中提出背景胰腺癌恶性程度极高,据统计,患者死亡率在恶性肿瘤中位列第4位。由于胰腺癌起病隐匿,发展十分迅速,绝大多数患者在初诊时就已出现病灶的局部浸润和器官远处转移,这是胰腺癌高死亡率的主要因素之一。因此,研究胰腺癌进展过程中的分子机制,对于理解胰腺癌致病机理以及提高胰腺癌诊治等方面具有指导意义。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,LncRNAs）是一类长度大于200nt的多聚腺苷酸RNA,具有组织和疾病特异性,序列保守性高。近年来发现,在胰腺癌中,存在着大量表达失衡的LncRNAs。由于LncRNAs广泛被转录,仍然有大量的LncRNAs功能未被注释,其在肿瘤中扮演的角色尚不清楚。因此,挖掘胰腺癌相关的LncRNAs并阐明其在肿瘤进展中的作用机制,成为了当前胰腺癌研究的热点之一。鉴于此,我们首先采用高通量基因芯片技术筛选、检测了胰腺癌中差异基因的表达情况。结果提示:与正常胰腺相比,胰腺癌组织中LncRNA RUNX1-IT1的表达明显上调。经数据库（NCBI）检索发现:RUNX1-IT1长度约为1502bp,定位于人类21号染色体。RUNX1-IT1于2017年在卵巢癌中报道,此研究发现RUNX1-IT1可以作为判别卵巢癌患者预后的标志物之一,高表达的卵巢癌患者无瘤生存时间更短,其肿瘤复发风险亦相对较高。近期有研究报道RUNX1-IT1在肝癌和结直肠癌的表达下调,细胞功能实验表明RUNX1-IT1可以影响肿瘤细胞的增殖和迁移,并诱导凋亡。总的来说,目前RUNX1-IT1在肿瘤中的研究并不多,更深层次的调控机制未见报道,其在胰腺癌中的表达意义和作用机制尚不清楚。因此我们拟通过临床检测及分析,体内外功能实验,下游靶点的高通量测序及转录调控等多层次对RUNX1-IT1进行解析,以明确RUNX1-IT1在胰腺癌的作用及机制。RUNX-IT1是从邻近基因RUNX1的内含子中转录出来的LncRNA,研究表明LncRNAs可通过调控邻近基因的表达从而发挥生物学效应。RUNX1是血液系统中的重要转录因子,其异常表达与造血功能异常和髓系白血病密切相关。近年来研究发现RUNX1在实体瘤中异常表达,可通过抑癌或促癌作用,双向调节恶性肿瘤的进程。因此我们推测,LncRNA RUNX1-IT1在胰腺癌中会不会通过作用于邻近基因RUNX1从而发挥生物学效应呢?综上所述,本研究主要集中在RUNX1-IT1是否能通过影响RUNX1的表达和功能从而促进胰腺癌的增殖和侵袭转移等过程。结合临床样本,分析RUNX1-IT1及邻近基因RUNX1在胰腺癌临床预后中的作用。另外,鉴于二者的表达相关性,通过高通量筛选并阐明二者的共同下游靶点也是本课题的重点内容。最后,基于我们的临床分析和机制研究,有望阐明RUNX1-IT1促进胰腺癌进展的作用机制,为胰腺癌诊治提供新靶点。目的1.明确RUNX-IT1及RUNX1在胰腺癌的表达及意义,评价RUNX1-IT1及RUNX1是否可作为胰腺癌独立预后评价指标。2.在细胞水平明确RUNX1-IT1的细胞表型以及是否经RUNX1发挥生物学效应。同时构建裸鼠胰腺原位移植瘤模型,并在动物水平上验证RUNX1-IT1/RUNX1信号轴对胰腺癌侵袭转移的影响。3.阐明RUNX1-IT1影响胰腺癌进展的下游调控网络和关键分子机制。主要包括两个方面:RUNX1-IT1上调RUNX1表达的分子机制研究;RUNX1-IT1/RUNX1共同调控下游靶点C-FOS的分子机制研究。方法1.采用高通量基因芯片（Affymetrix HTA2.0 Array）筛选技术检测了胰腺癌中差异基因的表达情况。联合GEO数据库集（GSE15471,GSE16515）,共同筛选出胰腺癌差异表达的关键分子RUNX1-IT1。通过采用荧光定量PCR（q PCR）和组织免疫原位杂交（ISH）等技术验证RUNX1-IT1在胰腺癌临床多中心样本中的表达情况。2.根据原位杂交的评分结果把胰腺癌患者分为RUNX1-IT1高低表达两组,统计两组病例间在病理分化、临床分期及患者预后等临床资料的差异,通过单因素和多因素分析评估RUNX1-IT1是否可作为胰腺癌患者的独立预后危险因素。3.在细胞水平探究RUNX1-IT1的生物学功能。首先,采用q PCR检测RUNX1-IT1在胰腺癌细胞中的表达水平,选择表达水平较高的细胞系进行基因沉默实验。在胰腺癌细胞中转染RUNX1-IT1 silencer下调其表达,并采用CCK8,Ed U,细胞划痕,Transwell等方法检测RUNX1-IT1在细胞增殖以及侵袭迁移等方面的作用,明确RUNX1-IT1的细胞表型。4.在体内水平检测RUNX1-IT1介导的原位肝转移能力。通过在裸鼠胰腺上接种RUNX1-IT1沉默的PANC-1稳转株细胞,构建胰腺原位移植瘤模型,并通过小动物核磁共振技术和HE染色明确胰腺癌最常见的腹腔肝转移情况和转移灶的病理特征。5.明确RUNX1-IT1经RUNX1发挥生物学功能。首先,通过免疫组化（IHC）检测RUNX1在胰腺癌临床多中心样本的表达情况,统计分析RUNX1的表达在患者临床资料中的意义。进一步通过相关性分析和亚组生存分析明确RUNX1-IT1和RUNX1在胰腺癌临床样本中的表达关联和预后价值。其次,通过q PCR,western blot,双荧光报告基因（reporter gene）,染色质免疫共沉淀（Ch IP）等技术明确RUNX1-IT1上调RUNX1的分子机制。最后,通过构建RUNX1-IT1和RUNX1相关的慢病毒稳转细胞系,在体内外水平明确RUNX1-IT1是否经RUNX1发挥生物学效应。6.探究RUNX1-IT1与RUNX1的共同下游靶点。首先,通过RNA结合蛋白的免疫共沉淀实验（RIP）明确RUNX1-IT1和RUNX1在体内的表达结合情况;其次,通过RNA-seq以及GSEA分析筛选RUNX1-IT1和RUNX1共同下游靶点,进一步采取q PCR,western blot以及细胞功能实验明确二者是否能够通过共同靶点C-FOS影响胰腺癌增殖及侵袭迁移。最后,采取免疫组化实验明确RUNX1-IT1/RUNX1/C-FOS信号轴在胰腺癌临床样本中的表达情况。7.明确RUNX1-IT1介导的RUNX1调控下游靶点C-FOS的分子机制。通过构建报告基因和CHIP等实验,阐明RUNX1-IT1通过结合RUNX1从而促进其对C-FOS启动子转录激活的调控机制。结果1.RUNX1-IT1在胰腺癌组织中高表达。通过分析多个中心的胰腺癌表达微阵列（GEO:GSE132956,GSE16515和GSE15471,前2000个差异基因）,联合筛选出胰腺癌中40个上调和23个下调的差异分子。在本课题中,我们集中分析了40个上调分子,因为它们更具有用作早期诊断标记或干预靶点的潜力。通过基因注释,发现RUNX1-IT1是上调基因中唯一的LncRNA,其它均为蛋白编码基因。采用在线编码评估工具进一步核实RUNX1-IT1的编码潜力,结果显示RUNX1-IT1缺乏蛋白质编码能力（编码概率能力:0.17;结果小于0.364为非编码序列;http://lilab.research.bcm.edu/cpat/）。接下来,q PCR结果表明:相对于癌旁组织,RUNX1-IT1在胰腺癌的表达量显着上调;采用免疫原位杂交实验检测了RUNX1-IT1在3个临床中心的175个胰腺癌和13个胰腺样本中的表达情况,统计发现RUNX1-IT1在胰腺癌临床多中心组织样本中显着高表达,此结果与RUNX1-IT1在基因芯片中观察的结果一致。2.RUNX1-IT1在胰腺癌中高表达与患者临床病理资料密切相关,是影响患者生存的独立危险因素。RUNX1-IT1的组织原位杂交统计分析显示,RUNX1-IT1表达水平与胰腺癌的肿瘤分化程度（P=0.005）、淋巴结浸润程度（P=0.001）和临床分期（P=0.007）呈正相关。生存分析发现高表达RUNX1-IT1组与胰腺癌总体生存率下降密切相关（P<0.001）。此外,单因素分析表明,低分化（P=0.015）,淋巴结转移（P=0.002）,临床高分期（P=0.002）和RUNX1-IT1高表达（P<0.001）增加了癌症相关的死亡风险。进一步的多因素分析表明,RUNX1-IT1是胰腺癌预后的独立危险因素（P<0.001）。综上提示RUNX1-IT1可能在胰腺癌临床进展中起着重要作用,具有一定的临床价值。3.下调RUNX1-IT1的表达可抑制胰腺癌的增殖和侵袭转移能力。CCK8和Ed U等细胞增殖实验发现,相对正常组,敲低RUNX1-IT1组的胰腺癌细胞活性下降,细胞增殖能力减弱;细胞划痕和Transwell侵袭迁移实验发现敲低RUNX1-IT1组的胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力均减弱。裸鼠胰腺原位移植瘤模型表明,在敲低RUNX1-IT1的动物组中,裸鼠肝脏表面上的转移灶数目显着减少,胰腺癌细胞的原位肝转移能力下降。这些数据提示RUNX1-IT1在体内外影响胰腺癌的增殖和侵袭迁移过程。4.RUNX1在胰腺癌中高表达并影响胰腺癌的进展。首先,免疫组化实验表明RUNX1在胰腺癌中高表达,并且与临床患者的临床分期,肿瘤大小,淋巴转移等指标密切相关（P<0.05）,多因素分析发现RUNX1可作为胰腺癌患者预后的独立危险因素（P=0.001）。细胞功能实验表明,下调RUNX1的表达后,胰腺癌细胞的增殖和侵袭迁移能力显着下降。胰腺原位移植瘤模型实验表明,在RUNX1敲低组,裸鼠肝脏表面上的微转移灶数目减少,胰腺癌细胞的原位肝转移能力下降。这些数据提示RUNX1在胰腺癌组织中高表达,并且下调其表达可以抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭迁移过程。5.RUNX1-IT1通过正向调控RUNX1的表达发挥生物学功能。首先,通过相关性分析发现,胰腺癌组织中RUNX1-IT1与RUNX1 m RNA表达具有正相关。基于RUNX1-IT1原位杂交和RUNX1免疫组化的数据,进行亚组分析发现,RUNX1-IT1与RUNX1均为高表达组别的患者预后最差（P<0.001）。其次,在细胞水平沉默RUNX1-IT1后发现RUNX1的m RNA和蛋白表达均下调,提示RUNX1-IT1对于RUNX1可能具有表达调控关系。通过构建RUNX1启动子报告基因,并共转染RUNX1-IT1的过表达或者干扰载体,发现RUNX1启动子的荧光强度发生相应的上调或下调,提示RUNX1-IT1可以在转录水平对RUNX1启动子进行正向调控。CHIP实验发现,RUNX1启动子区域存在H3K27Ac的修饰,并且改变RUNX1-IT1的表达可以影响RUNX1启动子区域的H3K27Ac修饰水平。最后,体外功能回复实验发现,过表达RUNX1-IT1可以促进胰腺癌的增殖和侵袭迁移,下调RUNX1的表达后,RUNX1-IT1介导的促癌效应减弱;胰腺原位移植瘤结果同样发现在过表达RUNX1-IT1的细胞中,下调RUNX1的表达可以削弱RUNX1-IT1诱导的原位肝转移,提示RUNX1-IT1可通过RUNX1发挥促癌的生物学效应。6.明确C-FOS是RUNX1-IT1与RUNX1的共同下游靶点。基于RUNX1-IT1和RUNX1在胰腺癌中的表达和功能一致性,我们拟研究二者是否共同参与下游基因的调控。首先,RIP实验发现RUNX1-IT1与RUNX1在胰腺癌细胞中呈现相互结合的状态,由此提示二者可能发挥类似的分子调控功能,作用于相同靶点。在下调RUNX1-IT1或者RUNX1后,分别行测序筛选下游靶点。通路富集分析（KEGG and GSEA）提示,RUNX1-IT1与RUNX1在胰腺癌中都参与了TNF信号通路的调节,通过二者共同的差异基因筛选发现C-FOS基因富集于TNF信号通路,且与RUNX1-IT1和RUNX1表达具有显着的相关性,并且q PCR和western blot结果证实RUNX1-IT1和RUNX1可以影响C-FOS的表达。接下来,采取细胞功能回复实验,发现敲低C-FOS的表达可以削弱RUNX1-IT1和RUNX1介导的促细胞增殖及侵袭迁移能力。为了进一步评估RUNX1-IT1和RUNX1表达与C-FOS信号通路之间的关系,我们在胰腺癌组织中进行了免疫组化检测,结果显示RUNX1-IT1、RUNX1、C-FOS及下游分子MMP9和CCND1在胰腺癌临床多中心的组织样本中具有显着的表达相关性。这些数据提示RUNX1-IT1和RUNX1可能互相作用并参与到下游靶标分子C-FOS的调控,从而进一步影响胰腺癌细胞的增殖和侵袭迁移等生物学过程。7.RUNX1-IT1通过结合并促进RUNX1对C-FOS基因的转录激活。首先,通过生物信息学分析预测了转录因子RUNX1在C-FOS启动子中的结合位点,发现RUNX1与C-FOS启动子可能存在4个潜在结合位点。构建C-FOS启动子的野生型和突变型载体,进行报告基因检测。发现与对照组相比,在敲低RUNX1组中C-FOS野生型的启动子荧光素酶活性明显下降,而在RUNX1过表达组则呈现相反的模式。RUNX1-IT1沉默和过表达组也有类似的结果。同时,突变载体的报告基因和Ch IP-PCR实验发现RUNX1可以影响C-FOS启动子3个位点的转录活性。为了验证RUNX1与C-FOS启动子位点的结合是否需要RUNX1-IT1,我们再次进行了双荧光素酶报告基因实验,结果发现在过表达RUNX1的组别中,下调RUNX1-IT1的表达,C-FOS启动子的活性明显减弱,表明敲低RUNX1-IT1的表达削弱了RUNX1介导的C-FOS启动子活性调控。并且Ch IP-PCR结果显示,敲低RUNX1-IT1降低了C-FOS启动子3个位点区域的RUNX1富集。这些结果表明RUNX1-IT1通过影响RUNX1与C-FOS启动子的富集调控C-FOS基因的转录。此外,基于上述结果促使我们想探究RUNX1-IT1是否可以作为独立的调控RNA,直接结合到C-FOS启动子位点上。采用Ch IRP实验,一种探测RNA与DNA相互作用的技术,我们分离出RUNX1-IT1结合的染色质DNA片段,并通过q PCR分析发现RUNX1-IT1与C-FOS启动子位点的直接结合率较低,表明RUNX1-IT1不能直接和C-FOS基因的启动子结合,需要通过与RUNX1作用从而发挥对C-FOS基因的转录调控。这一发现证实了RUNX1-IT1可能是RUNX1的转录协调因子。结论RUNX1-IT1在胰腺癌中可发挥促癌作用,参与调控胰腺癌的增殖,侵袭和转移过程。RUNX1-IT1和RUNX1可作为评估胰腺癌预后的独立危险因素,此发现可能对胰腺癌的临床预后判别具有一定的指导意义。在分子机制方面,RUNX1-IT1通过上调RUNX1的表达以及促进RUNX1对C-FOS基因启动子的富集,影响胰腺癌下游基因的表达和促进胰腺癌的进展。最后,新发现的RUNX1-IT1/RUNX1/C-FOS信号轴可能为阐明胰腺癌的作用机理和临床诊治方面提供理论依据和潜在的治疗靶点。
孔凯文[6]（2020）在《肿瘤来源外泌体通过驯化肝脏微环境促进胰腺导管腺癌肝转移》文中研究说明肿瘤的转移是癌症患者致死的主要原因,在病理学分期上,肿瘤的远处器官转移往往代表了疾病已发展到了晚期,部分患者往往已失去手术机会,5年生存率低。因此,在肿瘤转移发生的每一阶段,寻找一些起主要作用的分子和细胞,将有助于预防和控制肿瘤的转移。1889年,外科医生Stephen Paget针对肿瘤转移的器官特异性提出了肿瘤“种子-土壤”学说,而现在越来越多的研究和证据证实肿瘤转移需要肿瘤细胞与微环境的协调;同时也拓展了很多针对种子（如化疗）和土壤（如EGFR抑制）的治疗方案。形成转移灶之前的肿瘤细胞简称循环肿瘤细胞（CTC）,其在第二器官形成转移灶的过程十分复杂、艰难。目前被认可的肿瘤转移前微环境的概念,在2005年由Lyden教授提出,其研究发现血管内皮生长因子受体1（Vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1）阳性的骨髓祖细胞（Hematopoietic progenitor cells,HPCs）在肿瘤分泌的VEGF动员下,定植在有成纤维细胞和成纤维样细胞活化的区域,促进靶器官中肿瘤转移相关蛋白及趋化因子的分泌,促进了肿瘤的黏附、定植和生长,形成转移前微环境。转移前微环境概念一经提出便受到了极大关注,多种肿瘤来源的分泌物质TDSFs（G-CSF、TGF-β、TNF-α、LOX等）、细胞外基质及骨髓来源细胞（肿瘤相关巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等）被证实参与了转移微环境的形成。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）目前被认为是肿瘤微环境中占比最多的免疫细胞,它们不仅可以阻止T细胞攻击肿瘤细胞,还可以分泌各种细胞因子,诱导肿瘤细胞,促进肿瘤血管生成,诱导肿瘤细胞的定植和生长。巨噬细胞因表型和功能的差别,可分为M1型和M2型巨噬细胞,当下认为M1型参与炎症反应和抗肿瘤等免疫反应;M2型则发挥抗炎和促肿瘤的作用。在肿瘤转移前微环境中,M1型可转化为M2型,而肿瘤相关巨噬细胞更接近于M2型巨噬细胞的功能表型。巨噬细胞通过对微环境的调控从而促进肿瘤的转移。Kupffer细胞是一群位于肝窦状隙的免疫细胞,属于单核-巨噬细胞的成员,相当于定居在肝脏内的巨噬细胞。2015年Costa Silva等研究证明,胰腺癌来源外泌体能够选择性的被肝细胞Kupffer摄取,引起TGF-β1分泌和肝星状细胞表达纤维连接蛋白,纤维连接蛋白的沉积导致肝纤维化微环境的形成,促进骨髓来源的细胞的募集,形成了肝转移前微环境。并且他们发现,肝脏当中80%能摄取外泌体的细胞为F4/80+和CD11b+的巨噬细胞。胰腺癌是消化道恶性肿瘤中恶性程度极高的疾病,5年生存率极低,死亡率几乎接近发生率。大多数胰腺癌患者在早期无明显的临床表型,一旦确诊往往已处于癌症的中晚期,一部分患者常伴有肝脏转移而失去手术治疗的机会。目前,胰腺癌的发病机制仍未阐明,大量的研究表明胰腺癌微环境在肿瘤进展过程具有促进作用,并且与肿瘤的转移、耐药、免疫耐受等有密切关系。外泌体是一种直径为30-100nm的细胞外囊泡,内含DNA、RNA、蛋白质和脂质等多种生物活性物质,起着细胞间通信的重要作用。已有研究表明,肿瘤背景下的各种细胞都可以分泌外泌体,这些来源的外泌体与肿瘤的发生发展、侵袭转移和促血管生成有关。模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRRs）是人体免疫系统识别内源性和外源性病原体并启动免疫应答的主要媒介,包括目前研究最多的Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）和维甲酸诱导基因-I（RIG-I）。Toll样受体在胞膜外区的部分可以识别受体及与其他辅助受体结合形成的受体复合物。TLRs是天然免疫系统的检察官,监视与识别各种不同的疾病相关分子模式（PAMP）,近期研究表明,细胞外囊泡（Extracellular vesicles,包括exosomes和microvesicles）可以作为TDSFs介导转移前微环境的形成,并且外泌体已被证实能够激活宿主细胞的多种TLRs（如TLR2、TLR4、TLR7与TLR8）,然后分泌细胞因子及趋化因子。所以转移前微环境形成之前,转移靶器官中的免疫细胞或基质上皮细胞等表达的PRRs（主要是TLRs）能够识别肿瘤来源的外泌体,从而引发炎症反应,趋化更多的骨髓来源细胞,协同形成转移前微环境。RIG-I作为重要的模式识别受体之一,主要起着识别细胞内病毒RNA和活化下游抗病毒免疫的功能,近来发现其在肿瘤发生发展中起着重要调控作用,如在乳腺癌中,RIG-I增强了乳腺癌治疗抵抗以及促进肿瘤侵袭转移。因此,基于以上的研究,我们采用胰腺癌肝转移的小鼠模型,探究肝脏中的转移前微环境的分子病理变化,并通过基因缺陷小鼠筛选起作用的模式识别受体,提出假设:胰腺癌来源的外泌体,驯化了肝脏转移前微环境中的巨噬细胞,即kupffer细胞。这些被驯化的肿瘤相关巨噬细胞可分泌细胞因子,促进了循环肿瘤细胞在此定植和生长。1.肿瘤来源外泌体驯化kupffer细胞促进趋化因子表达上调肝转移瘤模型最常用的建模方式是脾脏注射和肝内直接种植,在本课题中我们选择脾脏注射肿瘤细胞来建立肝转移模型。此法可以很好的模拟胰腺癌从他处释放、侵袭血管、侵犯血管内和驯化转移灶微环境直至肿瘤继发生长的一系列级联过程,从而塑造胰腺癌转移前微环境。实验所用到的细胞株包括人来源的BXPC3、Panc-1、CFPAC和小鼠来源的细胞株Pan02,分别注射到无胸腺裸鼠,即裸鼠,和C57小鼠,采用小鼠活体成像和活体解剖来观察胰腺癌肝转移情况和验证其确为胰腺肿瘤。结果显示,Pan02细胞系建模成功率最高,其次为Panc-1。活体荧光成像以及活检HE片子都显示了该癌细胞能通过一系列转移途径,最后定植到小鼠肝脏中。我们采用Pan02-C57、Panc-1-裸鼠两种小鼠模型,采用梯度分离法提取不同时期小鼠肝脏的kupffer细胞并通过流式细胞分选纯化,将提取的Kupffer细胞一部分用Trizol裂解保存,后续可进行转录组测序;一部分用Q-PCR法验证。测序结果显示,被驯化的Kupffer细胞,其多种趋化因子的表达量明显升高,且Q-PCR显示其中CCL3、CCL4、CXCL3、CXCL15等趋化因子在m RNA水平明显上调。这些趋化因子对肿瘤细胞的定植生长起到很大的作用。此外,我们搜集了临床样本,采用免疫组织化学方法验证,在胰腺癌微小肝转移灶中,CD68阳性的Kupffer细胞明显多于正常肝脏组织。最后,我们得出结论,在胰腺癌肝转移模型中,大量聚集的Kupffer细胞被驯化活化,从而引起了多种趋化因子的上调表达,进一步促进了肿瘤细胞的转移。2.外泌体通过My D88依赖的TLR4通路驯化Kupffer细胞促进胰腺癌肝转移为了探究肿瘤来源的外泌体对肝脏Kupffer细胞的活化作用和相关机制,我们提出提问,肿瘤来源外泌体中的何种有效成分激活的Kupffer细胞使其成为肿瘤相关巨噬细胞?Kupffer细胞被激活的机制和信号通路有哪些?我们首先采用体外培养肿瘤组织,然后使用超速离心法提取外泌体,采用电镜法鉴定其为直径30-100um的囊泡小体。其次,我们采用腹腔灌洗获得小鼠的腹腔巨噬细胞,将其在体外培养,贴壁,静息。为了探究不同浓度和不同时间条件下外泌体对巨噬细胞的活化作用,最后得到最佳刺激浓度和最佳刺激时间结果。根据此结果,我们还探究了是外泌体中的何种有效成分刺激了巨噬细胞,是DNA,RNA,还是蛋白?通过分别加入DNA酶,RNA酶和蛋白酶,我们得出结论,外泌体含有的蛋白对巨噬细胞的活化程度最明显。目前研究认为,模式识别受体是外泌体活动的下游受体,他们可以识别外泌体所携带的危险信号,从而启动免疫应答,包括TLR2、TLR4、TLR7、TLR8以及RIG-I。为了研究外泌体活化巨噬细胞下游的信号通路,我们采用野生型和缺陷型小鼠进行比较,分别提取WT、TLR3-/-、MYD88-/-、TLR4-/-、TLR7-/-、TLR9-/-、RIG-I-/-小鼠的巨噬细胞,加以最适条件的外泌体刺激,然后观察巨噬细胞活化情况。最后发现模式受体TLR4为肝脏Kupffer细胞接受外泌体刺激的主要受体。
史秀慧[7]（2020）在《胰腺癌中预后相关非编码RNA的筛选与LINC01060的功能及作用机制研究》文中研究说明背景与目的:胰腺癌是消化道系统的高度恶性肿瘤,其治疗效果不佳,且缺乏有效的诊断与预后评估标志物。在本篇论文中,我们评估了长链非编码RNA和微小RNA在胰腺癌中作为预后标志物的潜在价值以及LINC01060在胰腺癌中的功能与机制。方法:在前两章,我们利用TCGA数据库中胰腺癌表达谱数据鉴定了胰腺癌中差异表达的mRNA、lncRNA和miRNA,并通过竞争性内源RNA（ceRNA）与基因共表达理论筛选出了胰腺癌中可能发挥关键作用的lncRNA与miRNA;接着,我们通过COX风险比例回归模型确定了可用于胰腺癌预后评估标志物的lncRNA与miRNA。此外,我们还对模型中的非编码在胰腺癌中的功能进行了初步的分析与探讨。在第三章,我们通过体外与小鼠体内实验研究了LINC01060在胰腺癌中的功能与机制。结果:第一,我们基于胰腺癌与癌旁组织间差异表达的lncRNA,建立了由LINC00460、C9orf139和MIG600HG表达量确定的胰腺癌风险预后评估模型,并评估了该模型的预测效果。第二,我们基于胰腺癌与癌旁组织间差异表达的miRNA,建立了由中mi R-203、mi R-424、mi R-1266、mi R-1293和mi R-4772表达量确定的胰腺癌风险预后评估模型,并评估了该模型的预测效果。第三,我们发现LINC01060在胰腺癌中发挥抑癌基因的作用,其通过调节黏着斑周转抑制胰腺癌的恶性进展。结论:首先,我们发现长链非编码RNA中的LINC0046、C9orf139和MIG600HG可作为胰腺癌术后患者风险评估的潜在联合预测标志物。其次,我们发现微小RNA中的mi R-203、mi R-424、mi R-1266、mi R-1293和mi R-4772可作为胰腺癌术后患者风险评估的潜在联合预测标志物。最后,我们发现LINC01060通过调节Vinculin表达在抑制胰腺癌进展中发挥重要作用,LINC01060-Vinculin-黏着斑信号轴是胰腺癌治疗的潜在靶点。第一章胰腺癌中预后相关长链非编码RNA的筛选背景与目的:在本章中,我们通过分析基因表达谱数据研究了lncRNA用于胰腺癌预后风险评估的潜在价值。方法:首先,我们利用TCGA数据库中的转录组数据筛选了胰腺癌组织与癌旁组织间差异表达的mRNA、miRNA和lncRNA。随后,我们基于ceRNA理论利用mi RTar Base、mi RDB、mi Rcode和Target Scan数据库构建了一个lncRNA-miRNA-mRNA共同表达网络。最后,我们通过将网络中与胰腺癌病人总体生存相关的lncRNA纳入COX比例风险回归模型,建立了基于lncRNA的胰腺癌预后评估模型。此外,在本章中我们还对预后风险评估模型中的lncRNA在胰腺癌中可能发挥的功能和涉及的信号通路等进行了初步探讨。结果:第一,构建了一个由43个lncRNA节点,11个miRNA节点,253个mRNA节点和475个边缘组成的lncRNA-miRNA-mRNA网络。第二,生存分析结果表明存在于ceRNA网络的46个lncRNA中,HOTTIP、ABHD11-AS1、MIR205HG、LINC00460、MIR600HG和C9orf139与胰腺癌术后病人总体生存时间相关。第三,COX比例风险回归分析表明LINC00460、MIR600HG和C9orf139可用于构建胰腺癌预后风险评估模型,Kaplan-Meier生存曲线分析表明该模型中的高风险组的中位生存时间与五年生存率均显着高于低风险组。结论:本章的研究结果表明,由LINC0046、C9orf139和MIG600HG构成的胰腺癌预后评估模型可以有效地对胰腺癌术后病人进行风险分层。LINC0046、C9orf139和MIG600HG是胰腺癌术后患者风险评估的潜在联合预测标志物。第二章胰腺癌中预后相关微小RNA的筛选背景与目的:在本章中,我们通过分析基因表达谱数据研究了miRNA用于胰腺癌预后风险评估的潜在价值。方法:我们利用第一章中筛选出的胰腺癌中差异表达miRNA,通过单因素与多因素COX回归分析对这些差异表达的miRNA进行筛选并建立比例风险预测模型。接着,通过miRNA靶基因预测、GO分析、KEGG通路分析、蛋白与蛋白相互作用分析和基因共同表达分析,研究了模型中miRNA在胰腺中所参与的信号通路与功能。此外,我们使用定量PCR验证了风险预测模型中的miRNA在20例胰腺癌组织中的表达。结果:通过COX回归分析,我们发现mi R-203、mi R-424、mi R-1266、mi R-1293和mi R-4772可用于构建有效预测胰腺癌病人总体生存期的比例风险预测模型。利用该模型计算胰腺癌病人的风险值后,将胰腺癌术后病人依据风险值高低分为高风险组（n=88）和低风险组（n=89）,两组的5年总体生存率分别为10.2%和47.8%。功能富集分析表明,参与模型构建的5个miRNA参与了PI3K-AKT、TGF-β和多能干细胞等信号传导途径。结论:本章的研究结果表明,由mi R-203、mi R-424、mi R-1266、mi R-1293和mi R-4772构成的胰腺癌预后评估模型可以有效地对胰腺癌术后病人进行风险分层。mi R-203、mi R-424、mi R-1266、mi R-1293和mi R-4772是胰腺癌术后患者风险评估的潜在联合预测标志物。第三章LINC01060在胰腺癌中的功能及作用机制研究背景与目的:长链非编码RNA的功能受到越来越多的关注,但其在胰腺癌中的作用仍有待进一步研究。本章首次研究了长链基因间非编码RNA01060在胰腺癌中的功能与机制。方法:首先,我们利用GEO数据分析了胰腺癌中差异表达的lncRNA,发现LINC01060在胰腺癌组织中的表达显着低于癌旁组织。随后,我们通过原位杂交实验在90例胰腺癌组织芯片中检测了LINC01060的表达情况,并分析了LINC01060的表达与胰腺癌临床病理特征之间的关系。此外,我们还通过体外和体内实验对LINC01060在胰腺癌中的功能与机制进行了进一步研究。结果:本研究发现LINC01060在胰腺癌组织中的表达较癌旁组织低,且其在不同胰腺癌病人中的低表达与预后不良显着相关。通过进一步的实验,我们发现LINC01060通过RNA水平调节Vinculin的表达,从而抑制胰腺癌的增殖和侵袭转移;Vinculin过表达可抑制LINC01060下调介导的FAK和Paxillin磷酸化的增加,从而逆转了LINC01060下调对黏着周转活性的调控。此外,Vinculin下调可通过上调ERK活性而促进胰腺癌细胞的增殖,抑制LINC01060上调介导的功能。结论:本研究发现,LINC01060通过调节Vinculin表达在抑制胰腺癌进展中具有重要作用,LINC01060-Vinculin-黏着斑信号轴是胰腺癌治疗的潜在靶点。第四章胰腺癌及非编码RNA研究进展加深对胰腺癌发生发展等方面的认识将有助于我们在改善胰腺癌预后方面取得进展。本章综述了近年来胰腺癌研究领域的重要进展,其中涉及发病因素、肿瘤微环境、诊断与预后的生物标志物、外科手术治疗、辅助与新辅助治疗和靶向治疗的研究进展。非编码RNA的发现让研究人员对疾病的认识产生了重要影响,现已成为生命科学研究领域最热门的话题之一。本章也综述了miRNA、lncRNA和其它非编码RNA的研究进展。
时霄寒[8]（2020）在《基于胰腺类器官库构建的胰腺癌分子分型及临床治疗的探索性研究》文中进行了进一步梳理背景:胰腺癌以恶性程度高、患者预后差着称。近年来,尽管胰腺癌相关研究在多方面取得进展,但患者生存期仍未得到显着改善。诊断发现晚、转移进展快及治疗效果差,是目前胰腺癌的主要问题所在,而对其深层次生物学特性认识的不足更加限制了胰腺癌诊疗手段的发展与进步。二代测序技术的发展壮大促使我们对肿瘤内在的生物学特点有了更深入的了解。通过巨视野切割或筛选及显微切割等技术手段克服间质成分过多的问题后,胰腺癌也积累了许多高质量的基因组学及转录组学测序分析研究。然而,仅仅局限于生物信息学分析和传统的实验模型,难以准确反映肿瘤实际的情况。首先,在胰腺癌细胞内部复杂的信号网络调控下,特定的基因突变或者信号通路改变是否真正为肿瘤所依赖难以明确。其次,基于肿瘤组织样本的分子分型虽然能一定程度加深对胰腺癌生物学特性的认识,但对于进一步挖掘潜在的功能差异及开发相关的治疗靶点并不具有太大的帮助作用。最后,在具体的临床实践中,能否用基因组学或转录组学测序完全反映胰腺癌患者的个体化差异从而指导治疗仍是巨大的疑问。在当代医疗发展的背景下,基于患者的肿瘤个体化研究模型逐渐被重视。类器官模型是其中新兴的热点之一,在对肿瘤个体化特性的保留方面已被多项研究所证实。作为基础研究模型,类器官可以有效取代传统2D细胞系进行具体基因或通路的功能验证,同时类器官模型具有极高的肿瘤细胞纯度,对于探索胰腺癌多层面的分子分型具有独特优势,并可以用于后续的功能差异探究及高通量药物筛选。此外,类器官模型还可以反映患者对临床用药的敏感性。在本研究中,我们尝试构建胰腺类器官库并用于基础及临床前试验。在组织形态学及基因组学水平验证胰腺癌类器官库与原肿瘤组织的一致性,并用于探索转录组学和染色质开放性的分子分型,开发可能有效的靶向药物,论证对患者化疗药物敏感性反映的准确性。第一部分胰腺类器官库的构建与鉴定目的探索及优化胰腺类器官培养基方案,构建包含不同病理亚型的胰腺癌及正常胰腺组织类器官库,并进行组织形态学及基因组学鉴定。方法1.利用手术及穿刺胰腺组织样本进行培养基方案测试及胰腺类器官库构建。2.利用苏木精-伊红染色法及免疫组织化学染色法对胰腺癌类器官、体内移植瘤及原肿瘤组织进行组织形态学鉴定。3.利用基因组学测序鉴定胰腺癌类器官的生物学特性,并与公共数据库中胰腺癌样本及原肿瘤组织的基因组学数据进行对比。结果1.通过对24种预设的培养基方案分别进行胰腺癌组织及正常胰腺组织的类器官培养测试,确定了最合适的培养基成分。2.通过手术及穿刺样本,最终构建83例胰腺癌类器官包含导管腺癌74例、腺鳞癌1例、神经内分泌肿瘤3例、腺泡细胞癌1例及导管内乳头状粘液性肿瘤4例共5种病理亚型和6例正常胰腺组织类器官,胰腺癌类器官的培养成功率为77.6%。3.胰腺癌类器官在形态结构上与体内移植瘤及原肿瘤组织均保持高度的相似性,并且在免疫组织化学染色中维持原肿瘤组织的特性。尤其神经内分泌肿瘤类器官在神经内分泌标志物SYN、CGA上与原肿瘤组织保持一致。4.通过对34例胰腺癌类器官和10例对应肿瘤组织分别进行全基因组测序和全外显子测序,获得了高质量的基因组学测序数据。5.与公共数据库中胰腺癌样本及原肿瘤组织的基因组学数据对比显示,胰腺癌类器官高度保留了胰腺癌的生物学特性,并与原肿瘤组织相一致。结论1.通过探索及优化胰腺类器官培养基成分,构建了包含正常胰腺组织与5种胰腺癌病理亚型（导管腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、腺泡细胞癌及导管内乳头状粘液性肿瘤）的胰腺类器官库。2.胰腺癌类器官在组织形态学水平上与原肿瘤组织特征相一致,并维持在体内移植瘤中。3.胰腺癌类器官在基因组学水平上保留胰腺癌的生物学特性,并与原肿瘤组织高度一致。第二部分利用类器官模型探索胰腺癌转录组学及染色质开放性的分子分型目的利用构建成功的类器官库探索胰腺癌转录组学及染色质开放性的分子分型,并筛选有效的表观遗传学小分子化合物。方法1.利用胰腺癌类器官及正常胰腺组织类器官进行转录组学测序并做分型分析。2.利用胰腺癌类器官及正常胰腺组织类器官进行染色质开放性测序并做分型分析。3.利用胰腺癌类器官进行表观遗传学小分子化合物库筛选,并结合染色质开放性分型进行分析。结果1.通过对43例胰腺癌类器官及3例正常胰腺组织类器官高质量的转录组学测序数据进行分析,将胰腺癌类器官分为4种亚型:经典型、基底样型、经典/祖细胞型及新定义的糖酵解活跃型。2.在TCGA公共数据库中,对新的胰腺癌转录组学分型进行验证显示,184例胰腺癌样本可以按照新转录组学分型的差异表达基因较好地分为4型,其中经典/祖细胞型患者预后最佳,而其余3种亚型包括新定义的糖酵解亚型患者预后均较差。3.通过分析41例胰腺癌类器官及3例正常胰腺组织类器官ATAC测序数据的片段大小、转录起始区开放程度相似性、测序质量控制评分及在公共数据库中染色质状态,证实获得的ATAC测序数据质量较高,可用于后续研究。4.进一步分析ATAC测序数据显示,胰腺癌类器官可以在染色质开放性上分为6个亚型,并各自富集不同的转录因子。5.分析283种表观遗传学小分子化合物在35例胰腺癌类器官初筛结果后,选择59种可能有较好抑制作用的小分子化合物对39例胰腺癌类器官进行复筛。其中发现,部分在染色质开放性分型中富集的转录因子可以作为小分子化合物敏感性的标志物。结论1.胰腺癌类器官在转录组学水平可以分为4种亚型:经典型、基底样型、经典/祖细胞型及糖酵解活跃型。2.胰腺癌类器官转录组学新分型可以在公共数据库中得到验证,生存分显示,经典/祖细胞型患者预后最佳,其余3种均较差。3.胰腺癌类器官在染色质开放性水平可以分为6种亚型,并且各个亚型以富集不同的转录因子为特点。4.胰腺癌类器官染色质开放性亚型可以用于指导靶向转录因子的个体化治疗。第三部分利用类器官模型个体化评估胰腺癌患者化疗药物敏感性目的利用构建成功的类器官库个体化评估胰腺癌患者的化疗药物敏感性,并进行体内验证。方法1.利用胰腺癌类器官进行化疗药物敏感性试验。2.收集对应患者的临床治疗及用药情况。3.结合对应类器官的化疗药物敏感性对患者进行生存分析及药物有效性分析。4.利用小鼠体内移植瘤模型,验证类器官体外化疗药物敏感性。结果1.利用35例胰腺癌类器官对6种化疗药物进行初筛,确定复筛使用的化疗药物及浓度梯度。2.利用39例胰腺癌类器官对5种胰腺癌一线化疗药物进行复筛,并根据剂量效应曲线的曲线下面积将类器官在每种药物中均分为敏感、中间敏感及不敏感三类。3.结合对应的39例胰腺癌患者临床治疗情况,将其分为优先根治性手术联合辅助化疗组（31例）、新辅助治疗组（2例）和优先根治性手术但未进行辅助化疗组（6例）进行后续分析,未行化疗的6例患者不做进一步分析。4.在优先根治性手术联合辅助化疗组中,根据胰腺癌类器官化疗药物敏感性及对应患者实际用药情况,我们将患者分为敏感组、中间敏感组及不敏感,生存分析显示,敏感组患者较中间敏感组及不敏感组患者有显着更长的无复发生存期,并在影像学检查资料中得到证实。5.在新辅助治疗组中,患者DAC-36新辅助治疗失败后从转移灶构建的类器官在化疗药物敏感性测试中表现出对使用过的药物均耐药;而患者DAC-38从穿刺样本构建的类器官在化疗药物敏感性测试中的表现与患者实际用药反应相一致。6.胰腺癌类器官DAC-18、DAC-20和DAC-36在小鼠体内移植瘤化疗药物敏感性实验中表现出与体外完全一致的结果。结论1.类器官模型可以用于准确评估胰腺癌患者化疗药物敏感性,指导术后个体化化疗。2.类器官模型可以用于胰腺癌患者新辅助治疗方案指导及新辅助治疗失败后下一步治疗探索。课题总结:1.本研究通过优化培养基方案,构建了包含正常胰腺组织与5种胰腺癌病理亚型（导管腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、腺泡细胞癌及导管内乳头状粘液性肿瘤）的胰腺类器官库。2.胰腺癌类器官库在组织形态学及基因组学水平上与原肿瘤组织保持高度一致,并保留公共数据库中的胰腺癌特性。3.胰腺癌类器官库在转录组学水平上分为4种亚型:经典型、基底样型、经典/祖细胞型及糖酵解活跃型,并在公共数据库中得到验证。4.胰腺癌类器官库在染色质开放性水平上分为以富集不同转录因子为特点的6种亚型,可以指导靶向转录因子的个体化治疗。5.胰腺癌类器官库可以用于个体化评估患者的化疗药物敏感性,指导术后辅助及新辅助化疗方案。
余倩[9]（2020）在《IVFC监测原位胰腺癌模型HIFU治疗前后CTCs变化的实验研究》文中提出目的:1.构建裸鼠皮下移植瘤及原位移植瘤胰腺癌模型循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）检测系统;2.比较两种模型肿瘤生长、CTCs变化和远处转移特征,探究两种模型是否存在差异及差异形成的原因;3.探究高强度聚焦超声（high-intensity focused ultrasound,HIFU）治疗对胰腺癌模型CTCs变化和肿瘤生长的影响。方法:1.通过慢病毒转染获取稳定表达红色荧光的人源性胰腺癌m Cherry-Bx PC-3细胞,再以流式细胞分选仪分选出荧光强度最高的部分细胞（约占细胞总数的1%）继续培养;2.以m Cherry-Bx PC-3细胞构建皮下移植瘤,再使用这一皮下移植瘤传代,分别构建第二代的皮下移植瘤和原位移植瘤胰腺癌模型;3.通过超声成像对肿瘤生长状况进行评价,采用活体流式细胞仪（in vivo flow cytometry,IVFC）定量分析循环肿瘤细胞数量的变化,通过观察瘤块及肝脏的组织切片比较皮下移植瘤和原位移植瘤的组织病理学特征及远处转移情况;4.采用IVFC和超声成像技术,对HIFU治疗前后血液循环中肿瘤细胞数量变化和肿瘤体积变化进行定量监测,评估HIFU治疗对CTCs变化和肿瘤生长的影响。结果:1.通过慢病毒转染,获得稳定表达红色荧光的人源性胰腺癌m Cherry-Bx PC-3细胞株;经流式分选,获得高荧光强度的细胞亚群;以皮下移植瘤块传代分别构建二代的裸鼠皮下移植瘤和原位移植瘤胰腺癌模型,成功率均可达100%（n=10）;2.原位移植瘤肿瘤生长速度明显快于皮下移植瘤,从肿瘤移植后约第10天开始出现统计学差异;原位移植瘤裸鼠生存时间约为（19.55±2.84）天,明显短于皮下移植瘤裸鼠生存时间（55.00±8.39）天;原位移植瘤裸鼠CTCs数量呈增长趋势,皮下移植瘤裸鼠CTCs数量始终处于较低水平;原位移植瘤模型于肿瘤移植后第21天经解剖后病理可见肝转移灶,皮下移植瘤模型未见明显肝转移;3.经HIFU治疗后IVFC连续监测,HIFU治疗组CTCs数量明显较未治疗组降低,分别为（4.50±1.29）个/小时和（22.75±2.22）个/小时;HIFU治疗后,治疗组肿瘤体积（476.20±185.12）mm3,明显小于未治疗组肿瘤体积（682.50±150.30）mm3,HIFU治疗有效减缓肿瘤生长。结论:1.裸鼠原位移植瘤模型较皮下移植瘤模型更适合用于转移性胰腺癌的研究;2.HIFU治疗不会增加原位移植瘤胰腺癌模型循环肿瘤细胞数量,并可有效的减缓肿瘤生长速度。
王宁[10]（2020）在《iRGD修饰的外泌体包裹anti-miR-25-3p用于胰腺癌靶向治疗的研究》文中研究表明研究目的:胰腺癌的恶性度高,且进展迅速,临床病例中极易发生转移,临床统计中仅有20%左右的患者在就诊时有手术机会,其他的患者则大多只能接受姑息化疗,胰腺癌的五年生存期仅5%左右。因此胰腺癌是目前最难以治疗的恶性肿瘤之一,且目前尚无任何有效治疗可以延长患者的的生存期和改善预后。近年来分子靶向治疗在某些肿瘤治疗中取得了一定的进步,在本课题中探究了miR-25-3p对胰腺癌细胞的作用和胰腺癌细胞对iRGD修饰的外泌体的靶向摄取作用,并将二者结合探索其在胰腺癌靶向治疗中的应用,以期日后可以通过此种治疗方式改善胰腺癌患者的生活质量,延长患者的生存时间。研究方法及结果:1.胰腺癌患者血清miR-25-3p血清表达情况及其与患者生存期相关性PCR对比临床样本后发现胰腺癌患者较体检正常人血清中miR-25-3p的表达量高,且胰腺癌患者血清中miR-25-3p的表达量与患者生存期呈负相关。2.Mi R-25-3p对胰腺癌细胞侵袭迁移能力的影响PCR比较不同胰腺癌细胞系miR-25-3p表达量后选取miR-25-3p表达量适中的panc-1和Bx PC-3细胞系进行后续实验,划痕愈合实验和transwell实验显示miR-25-3p可促进胰腺癌细胞的侵袭迁移能力。3.外泌体装载的anti-miR-25-3p对胰腺癌细胞侵袭迁移能力的影响对不同处理组胰腺癌细胞进行transwell和划痕愈合实验后显示外泌体装载的anti-miR-25-3p可被胰腺癌细胞摄取并抑制胰腺癌细胞的侵袭迁移。4.构建iRGD肽段修饰的外泌体运载anti-miR-25-3p免疫荧光和western blot结果显示过表达3×FLAG-iRGD-CD63融合蛋白的外泌体构建成功,PCR结果显示iRGD肽段修饰且装载anti-miR-25-3p的外泌体构建成功。荧光显微镜观察到体外胰腺癌细胞对iRGD修饰且装载anti-miR-25-3p的外泌体呈高摄取趋势,小动物成像结果显示胰腺癌细胞在体内对iRGD修饰且装载anti-miR-25-3p的外泌体呈特异性高摄取。5.iRGD修饰的外泌体包裹anti-miR25-3p的胰腺癌治疗效果对胰腺癌原位模型小鼠治疗过程中发现iRGD修饰且包裹anti-miR-25-3p外泌体的治疗可减慢小鼠体重的下降;对小鼠肝脾组织的HE染色结果显示iRGD修饰且其中包裹anti-miR-25-3p的外泌体治疗可以显着抑制小鼠胰腺癌的肝转移和脾转移;对小鼠的心肺肾HE染色结果结果显示外泌体注射治疗会一定程度上导致小鼠心脏、脾脏等产生炎症反应,但对于小鼠心脏纤维化、脾细胞坏死、脾出血、肺出血等情况有一定的改善作用。研究结论:本课题中,胰腺癌患者血清中miR-25-3p呈高表达趋势,且miR-25-3p的表达水平与患者的生存期呈负相关。Mi R-25-3p可促进胰腺癌细胞的侵袭迁移能力。胰腺癌细胞在体内和体外均可对iRGD修饰的外泌体快速靶向摄取且在小鼠胰腺癌原位模型的治疗中iRGD修饰且其中装载anti-miR-25-3p的外泌体可以抑制小鼠胰腺癌的肝转移和脾转移。
二、胰腺癌肝转移体外模型的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胰腺癌肝转移体外模型的构建（论文提纲范文）
（1）多模态成像指导的协同治疗胰腺癌的多功能诊疗纳米材料的合成与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 胰腺癌诊断与治疗的现状与挑战 |
| 1.2 诊疗类纳米材料用于胰腺癌的成像诊断 |
| 1.2.1 光学成像 |
| 1.2.2 超声及光声成像 |
| 1.2.3 CT成像 |
| 1.2.4 核成像 |
| 1.2.5 MR成像 |
| 1.2.6 多模态成像 |
| 1.3 诊疗类纳米材料用于胰腺癌的治疗 |
| 1.3.1 抗基质治疗 |
| 1.3.2 光热治疗 |
| 1.3.3 光动力治疗 |
| 1.3.4 基因治疗 |
| 1.3.5 免疫治疗 |
| 1.4 论文选题意义和研究目的 |
| 第二章 光声/光热双模态成像指导下的脂质体包覆的石墨烯@金纳米星用于胰腺癌的基因与光热协同治疗 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 药品与试剂 |
| 2.2.2 GO@AuNS的制备 |
| 2.2.3 制备rGO@AuNS-DODAB/DOPE-FA |
| 2.2.4 rGO@AuNS-DODAB/DOPE-FA纳米载体的表征 |
| 2.2.5 光热性能及光热稳定性的研究 |
| 2.2.6 K-Ras shRNA表达载体的构建 |
| 2.2.7 琼脂糖凝胶迁移实验 |
| 2.2.8 细胞培养及DNA靶向递送和转染能力实验 |
| 2.2.9 免疫印迹实验 |
| 2.2.10 细胞活性毒性实验 |
| 2.2.11 细胞凋亡实验 |
| 2.2.12 动物肿瘤模型建立 |
| 2.2.13 药代动力学和生物分布研究 |
| 2.2.14 体内外光声成像实验 |
| 2.2.15 体内光热成像 |
| 2.2.16 体内基因/光热协同治疗 |
| 2.2.17 组织切片染色 |
| 2.2.18 统计分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 rGO@AuNS-DODAB/DOPE-FA的制备与表征 |
| 2.3.2 光热性能及光热稳定性 |
| 2.3.3 K-Ras shRNA质粒的构建 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶迁移实验 |
| 2.3.5 靶向递送和转染能力 |
| 2.3.6 rGADA-KrasI靶向下调Capan-1细胞中突变的K-Ras基因 |
| 2.3.7 细胞活性毒性及凋亡实验 |
| 2.3.8 体内分布及代谢 |
| 2.3.9 光声及光热成像 |
| 2.3.10 荷载Capan-1 肿瘤的动物模型中的基因/光热协同治疗及病理学研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 一步法制备热刺激响应的功能化的金纳米花用于多模态成像指导基因与光热协同治疗胰腺癌 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 药品与试剂 |
| 3.2.2 制备普鲁士蓝类似物PBA |
| 3.2.3 Lipo-PBA-Au-cRGD(LPBGD)的制备 |
| 3.2.4 LPBGD纳米载体的表征 |
| 3.2.5 光热性能及光热稳定性的研究 |
| 3.2.6 相变温度的检测 |
| 3.2.7 琼脂糖凝胶迁移实验及负载和释放实验 |
| 3.2.8 细胞培养及靶向递送验证 |
| 3.2.9 免疫印迹实验 |
| 3.2.10 细胞活性毒性实验 |
| 3.2.11 细胞凋亡实验 |
| 3.2.12 动物肿瘤模型建立 |
| 3.2.13 体内药物分布研究 |
| 3.2.14 体内外光声成像实验 |
| 3.2.15 体内外CT成像、光热成像 |
| 3.2.16 体内基因/光热协同治疗 |
| 3.2.17 组织切片染色及血液生化分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Lipo-PBA-Au-cRGD的制备与表征 |
| 3.3.2 光热性能及相变温度研究 |
| 3.3.3 琼脂糖凝胶迁移实验及负载释放实验 |
| 3.3.4 靶向递送能力 |
| 3.3.5 LPBGD靶向下调Panc-1 细胞中K-Ras基因 |
| 3.3.6 细胞活性毒性及凋亡实验 |
| 3.3.7 体内分布研究 |
| 3.3.8 光声、CT及光热成像 |
| 3.3.9 荷载Panc-1 肿瘤的动物模型中的基因/光热协同治疗及病理学研究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 双靶向的上转换纳米粒子作为成像诊断剂和过氧化氢酶用于乏氧胰腺癌的光热光动力协同治疗 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 药品与试剂 |
| 4.2.2 制备上转换核壳纳米粒子 |
| 4.2.3 制备UCNP@TA/Fe、UCNP@TA/Fe-TPP、UCNP@TA/Fe-TPP-c RGD |
| 4.2.4 光敏剂(PC4)的装载 |
| 4.2.5 UCNP@TA/Fe-TPP-cRGD纳米载体的表征 |
| 4.2.6 光热性能及光热稳定性的研究 |
| 4.2.7 光敏剂(PC4)的负载和释放实验 |
| 4.2.8 体内外产氧实验 |
| 4.2.9 体内外产生ROS实验 |
| 4.2.10 线粒体靶向膜电位变化及cRGD靶向递送验证 |
| 4.2.11 细胞活性毒性实验 |
| 4.2.12 细胞凋亡实验 |
| 4.2.13 动物肿瘤模型建立 |
| 4.2.14 体内药物分布研究 |
| 4.2.15 体内外光声成像实验 |
| 4.2.16 体内外核磁共振成像、光热成像研究 |
| 4.2.17 光热/光动力协同治疗 |
| 4.2.18 组织切片染色及血液生化分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 UCNP@TA/Fe-TPP-cRGD的制备与表征 |
| 4.3.2 光热性能和光敏剂PC4 负载及pH响应释放实验 |
| 4.3.3 体内外产生氧气及产生ROS |
| 4.3.4 靶向递送能力 |
| 4.3.5 细胞活性毒性及凋亡实验 |
| 4.3.6 体内分布研究 |
| 4.3.7 核磁共振成像、光声成像及光热成像 |
| 4.3.8 荷载Capan-1 肿瘤的动物模型的光热/光动力协同治疗及病理学研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 论文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）长链非编码RNA PTTG3P在胰腺癌细胞生长与转移中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA PTTG3P在胰腺癌中的表达及临床意义 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 LncRNA PTTG3P对胰腺癌细胞生物学行为的影响 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三部分 LncRNA PTTG3P/miR-132/212-3p/FoxM1 调控胰腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的分子机制研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第四部分 FoxM1 转录调控lncRNA PTTG3P在胰腺癌细胞中的表达 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 全文小结 |
| 一、主要研究结果 |
| 二、创新点 |
| 三、潜在应用价值 |
| 综述 长链非编码 RNA 在胰腺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）胰腺癌肿瘤免疫微环境预后模型的构建和潜在治疗靶点的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分: 胰腺癌免疫微环境中与预后相关的多因子调控网络模型的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 第二部分: 胰腺癌肿瘤免疫微环境中潜在治疗靶点ISG20的作用及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第一小节 ISG20对胰腺癌恶性生物学行为调控的探索 |
| 第二小节 ISG20对胰腺癌恶性生物学行为调控的分子机制研究 |
| 第三小节 ISG20在胰腺癌组织中的表达及与预后的相关性研究 |
| 结论 |
| 全文讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Epigenetic Regulation that involves Tumor Associated Macrophage |
| Reference |
| 攻读学位期间取得的研究成果及奖励 |
| 致谢 |
（4）结直肠癌和食管癌标志分子RAD23B和TSP-1的验证、功能研究和检测体系的建立（论文提纲范文）
| 基金资助 |
| 缩略语索引表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 结直肠癌新的潜在标志分子——RAD23B |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 1.1 尿液样本 |
| 1.2 组织芯片 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 二、方法 |
| 2.1 Dot blot分析 |
| 2.2 免疫组化 |
| 2.3 评分标准 |
| 三、统计学处理 |
| 结果 |
| 1.TCGA数据库中RAD23B在结直肠癌中的表达 |
| 2.RAD23B蛋白在结直肠癌组织中表达水平升高 |
| 3.胞浆RAD23B表达水平与结直肠癌的病理分级和AJCC分期相关 |
| 4.结直肠癌细胞胞浆RAD23B表达水平升高与结直肠癌肝转移相关 |
| 5.结直肠癌组织细胞浆RAD23B的表达与结直肠癌的总生存期缩短相关 |
| 7.结直肠癌患者尿液中RAD23B水平增高 |
| 8.结直肠癌尿液蛋白RAD23B与结直肠癌肝转相关 |
| 9.尿蛋白RAD23B是结直肠癌肝转移的潜在的生物标志物 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 RAD23B促进结直肠癌进展的机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 质粒 |
| 1.4 RAD23B小干扰RNA(siRNA) |
| 1.5 RAD23B shRNA |
| 1.6 实验小鼠 |
| 1.7 主要试剂 |
| 1.8 主要仪器设备 |
| 二、方法 |
| 2.1.细胞培养 |
| 2.2 细菌转化 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 稳定转染细胞的筛选 |
| 2.5 细胞蛋白提取 |
| 2.6 BCA法蛋白浓度测定 |
| 2.7 Western Blot |
| 2.8 免疫荧光分析 |
| 2.9 细胞增殖实验 |
| 2.10 Transwell实验 |
| 2.11 细胞划痕实验 |
| 2.12 细胞克隆形成实验 |
| 2.13 RNA-seq |
| 2.14 Balb/c裸鼠皮下荷瘤实验 |
| 2.16 免疫共沉淀实验 |
| 三、统计学处理 |
| 结果 |
| 1.RAD23B蛋白在不同结直肠癌细胞系的表达 |
| 2.蛋白RAD23B结直肠癌细胞内的定位 |
| 3.瞬时敲降RAD23B的结直肠癌细胞构建 |
| 4.siRNA主要抑制结直肠癌细胞质中RAD23B的表达 |
| 5.敲降RAD23B抑制结直肠癌的增殖能力 |
| 6.敲降RAD23B抑制结直肠癌细胞的运动能力 |
| 7.SW480细胞敲降RAD23B的RNA-seq分析 |
| 8.KEGG和IPA分析显示整合素信号通路被抑制 |
| 9.Western blot检测TaHnl/2/Integrn/RhoA信号通路相关分子 |
| 10.敲降RAD23B能够抑制结直肠癌在小鼠体内的增殖能力 |
| 11.敲降RAD23B能够抑制结直肠癌在小鼠体内的肝转移能力 |
| 12.IP-MS提示RAD23B与COROIC存在相互作用 |
| 13.免疫共沉淀证实RAD23B与COROIC蛋白相互作用 |
| 14.RAD23B与COROIC蛋白在结直肠癌细胞和组织中共定位 |
| 15.瞬时过表达RAD23B的结直肠癌细胞构建 |
| 16.RAD23B促进COROIC向结直肠癌细胞边缘聚集 |
| 17.RAD23B和COROIC促进侵袭性伪足的形成 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 食管癌早诊标志物血浆TSP-1多肽检测体系的建立 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 1.1 血浆 |
| 1.2 小鼠 |
| 1.3 细胞系 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 常用试剂及配制 |
| 1.6 主要仪器设备 |
| 二、方法 |
| 2.1 多肽及合成 |
| 2.2 多肽偶联 |
| 2.3 免疫小鼠 |
| 2.4 细胞融合实验 |
| 2.5 单克隆杂交瘤细胞株筛选 |
| 2.6 配对检测抗体的选择 |
| 2.7 抗体磁珠偶联 |
| 2.8 TSP-1化学发光法检测体系 |
| 三、统计学处理 |
| 结果 |
| 1.多肽偶联效率 |
| 2.小鼠血清多克隆抗体滴度测定 |
| 3.TSP-1肽段N端抗体单克隆株筛选 |
| 4.TSP-1肽段C端抗体单克隆株筛选 |
| 5.TSP-1肽段N端单克隆抗体特异性 |
| 6.TSP-1肽段C端单克隆抗体特异性 |
| 7.TSP-1肽段双抗体夹心ELISA初步验证 |
| 8.TSP-1肽段化学发光法检测体系建立 |
| 9.TSP-1在是食管癌早期筛查及诊断中的作用和意义 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述1 RAD23B的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述2 肿瘤标志分子TSP-1的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 附件: 研究生期间获奖证书和发表文章 |
（5）LncRNA RUNX1-IT1经RUNX1促进胰腺癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 RUNX1-IT1 在胰腺癌中的表达情况及其临床相关性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 下调RUNX1-IT1 抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 RUNX1-IT1经RUNX1 发挥生物学效应 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 C-FOS为 RUNX1-IT1和RUNX1 的共同下游靶点 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小节 |
| 第六章 RUNX1-IT1 通过RUNX1 影响C-FOS的转录激活 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 转录因子RUNX1与实体瘤相关的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）肿瘤来源外泌体通过驯化肝脏微环境促进胰腺导管腺癌肝转移（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 肿瘤来源外泌体驯化KUPFFER细胞促进趋化因子表达上调 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 外泌体通过TLR4 驯化KUPFFER细胞促进胰腺癌肝转移 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 胰腺导管腺癌的研究模型进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历、研究生期间发表的论文及国内外学术交流 |
| 致谢 |
（7）胰腺癌中预后相关非编码RNA的筛选与LINC01060的功能及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 胰腺癌中预后相关长链非编码RNA的筛选 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 胰腺癌中预后相关微小RNA的筛选 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 LINC01060在胰腺癌中的功能及作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 胰腺癌及非编码RNA研究进展 |
| 1.胰腺癌研究进展 |
| 2.非编码RNA研究进展 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 中英文缩略词对照表 |
| 附录2 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录3 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 附录4 攻读博士学位期间获得的奖项与荣誉 |
| 致谢 |
（8）基于胰腺类器官库构建的胰腺癌分子分型及临床治疗的探索性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 胰腺类器官库的构建与鉴定 |
| 一、背景 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 利用类器官模型探索胰腺癌转录组学及染色质开放性的分子分型 |
| 一、背景 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 利用类器官模型个体化评估胰腺癌患者化疗药物敏感性 |
| 一、背景 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 综述 类器官模型在胰腺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）IVFC监测原位胰腺癌模型HIFU治疗前后CTCs变化的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 1、胰腺癌的诊治现状 |
| 2、胰腺癌HIFU治疗 |
| 3、胰腺癌循环肿瘤细胞的检测 |
| 4、胰腺癌循环肿瘤细胞影响因素 |
| 第一章 胰腺癌异种移植模型及检测系统的构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 稳定转染细胞系 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 试剂和仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞转染和筛选 |
| 1.2.3 流式细胞检测仪鉴定m Cherry表达阳性率 |
| 1.2.4 胰腺癌异种移植动物模型构建 |
| 1.2.5 活体流式细胞仪(IVFC)系统 |
| 1.2.6 超声成像评估肿瘤生长情况 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 稳定转染细胞系的构建 |
| 1.3.2 胰腺癌异种移植模型构建 |
| 1.3.3 胰腺癌异种移植模型检测系统的构建 |
| 1.4 讨论和小结 |
| 第二章 胰腺癌皮下移植瘤及原位移植瘤肿瘤生长、CTC_S变化的实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 稳定转染细胞系 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物模型的实验分组 |
| 2.2.2 动物模型基本情况监测 |
| 2.2.3 超声成像监测肿瘤生长情况 |
| 2.2.4 IVFC监测循环肿瘤细胞 |
| 2.2.5 解剖及病理检测 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 动物模型的特征观察 |
| 2.3.2 肿瘤生长情况的超声监测 |
| 2.3.3 胰腺癌循环肿瘤细胞的IVFC监测 |
| 2.3.4 病理检测 |
| 2.4 讨论和小结 |
| 第三章 HIFU治疗对胰腺癌模型CTC_S变化和肿瘤生长的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 稳定转染细胞系 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 试剂和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 高强度聚焦超声仪器设备 |
| 3.2.2 肿瘤分组及HIFU治疗参数 |
| 3.2.3 HIFU治疗流程 |
| 3.2.4 HIFU治疗前后肿瘤声像图变化评价 |
| 3.2.5 IVFC检测HIFU治疗前后CTCs变化 |
| 3.2.6 病理检测 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HIFU治疗前后肿瘤声像图变化 |
| 3.3.2 HIFU治疗对肿瘤生长的影响 |
| 3.3.3 HIFU治疗对CTCs的影响 |
| 3.3.4 病理检测 |
| 3.4 讨论和小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（10）iRGD修饰的外泌体包裹anti-miR-25-3p用于胰腺癌靶向治疗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、胰腺癌患者血清miR-25-3p血清表达情况及其与患者生存期的相关性 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、MiR-25-3p对胰腺癌细胞侵袭迁移能力的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 使用的细胞系以及培养条件 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要实验方法 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、外泌体装载的anti-miR-25-3p对胰腺癌细胞侵袭迁移能力的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 使用的细胞系以及培养条件 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 获取装载anti-miR-25-3p的外泌体 |
| 3.2.2 外泌体中装载的anti-miR-25-3p可抑制胰腺癌细胞的侵袭迁移能力 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、构建iRGD肽段修饰的外泌体运载anti-miR-25-3p |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 使用的细胞系以及培养条件 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 获取3×FLAG-iRGD-CD63 修饰且装载anti-miR-25-3p的外泌体 |
| 4.2.2 iRGD修饰的外泌体可对胰腺癌进行靶向治疗 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、iRGD修饰的外泌体包裹anti-miR25-3p的胰腺癌治疗效果 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 使用的细胞系以及培养条件 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体:基因治疗领域的新兴载体 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、胰腺癌肝转移体外模型的构建（论文参考文献）
- [1]多模态成像指导的协同治疗胰腺癌的多功能诊疗纳米材料的合成与应用[D]. 贾修娜. 吉林大学, 2021(01)
- [2]长链非编码RNA PTTG3P在胰腺癌细胞生长与转移中的作用及机制研究[D]. 唐健. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]胰腺癌肿瘤免疫微环境预后模型的构建和潜在治疗靶点的研究[D]. 李桐. 北京协和医学院, 2021
- [4]结直肠癌和食管癌标志分子RAD23B和TSP-1的验证、功能研究和检测体系的建立[D]. 李军. 北京协和医学院, 2021
- [5]LncRNA RUNX1-IT1经RUNX1促进胰腺癌进展的机制研究[D]. 刘淞淞. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [6]肿瘤来源外泌体通过驯化肝脏微环境促进胰腺导管腺癌肝转移[D]. 孔凯文. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [7]胰腺癌中预后相关非编码RNA的筛选与LINC01060的功能及作用机制研究[D]. 史秀慧. 华中科技大学, 2020(02)
- [8]基于胰腺类器官库构建的胰腺癌分子分型及临床治疗的探索性研究[D]. 时霄寒. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [9]IVFC监测原位胰腺癌模型HIFU治疗前后CTCs变化的实验研究[D]. 余倩. 上海交通大学, 2020
- [10]iRGD修饰的外泌体包裹anti-miR-25-3p用于胰腺癌靶向治疗的研究[D]. 王宁. 天津医科大学, 2020(06)