u-PAR反义RNA表达质粒的构建及其转染高侵袭性PC-3M细胞亚克隆

一、Construction of Antisense RNA Expression Plasmid for u-PAR and Its Transfection to Highly Invasive PC-3M Cell Subclones（论文文献综述）

王素梅^[1]（2008）在《组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究》文中指出卵巢恶性肿瘤是最常见的女性恶性肿瘤之一,5年存活率低,侵袭和转移是卵巢恶性肿瘤重要的生物学特征,是引起卵巢恶性肿瘤患者死亡的主要原因。组织蛋白酶通过降解细胞外基质（ECM）,从而在肿瘤的侵袭和转移中起关键性的作用。组织蛋白酶抑制剂可抑制组织蛋白酶的活性,组织蛋白酶及其抑制剂的平衡失调可促进肿瘤的侵袭和转移。本研究的目的是探讨组织蛋白酶及其抑制剂在卵巢恶性肿瘤中的表达及与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系,探讨血清中组织蛋白酶L（CTSL）及其组织抑制剂（CC）对卵巢恶性肿瘤的诊断意义,并通过体外实验进一步探讨CTSL与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系,从而寻找卵巢恶性肿瘤基因治疗的方法。组织蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢组织中的表达及临床价值目的:探讨组织蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢组织中的表达及临床价值。方法:应用RT-PCR方法检测47例卵巢恶性肿瘤患者,20例卵巢良性肿瘤患者,21例正常卵巢组织中CTSB、CTSL、CTSD、CC的mRNA表达,进行阳性率和半定量的比较,并分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理的关系。结果:CTSB、CTSL、CC在卵巢恶性肿瘤组织中的半定量明显高于卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织（p＜0.05）;CTSD在三组之间的表达无统计学意义（p＞0.05）;CTSB的表达与腹水量和组织学类型有关（p＜0.05）;CTSL的表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移有关（p＜0.05）;CC的表达与病理分级、肝转移和大网膜转移有关（p＜0.05）;CTSD的表达与肝转移和腹水量的多少有关（p＜0.05）;单因素生存分析CTSL阳性率与患者的预后相关（p＜0.05）,Cox比例风险回归模型分析CTSL阳性率是卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:卵巢恶性肿瘤中CTSB、CTSL、CC表达增高,并与卵巢恶性肿瘤转移有关,有可能成为卵巢恶性肿瘤预测转移和预后的指标。血清CTSL及CC含量测定在卵巢恶性肿瘤中的临床价值目的:探讨CTSL及CC在卵巢恶性肿瘤患者血清中的含量及其临床意义。方法:采用ELISA方法检测64例卵巢恶性肿瘤、23例卵巢良性肿瘤及20例正常对照血清中CTSL及CC的含量,并对其中17例初诊卵巢恶性肿瘤手术患者进行术前、术后血清CTSL和CC含量的动态观察,将结果与临床资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox比例风险回归模型分析。结果:卵巢恶性肿瘤患者血清中CTSL及CC的含量显着高于良性组及正常对照组,差异有统计学意义（p＜0.05）;同一患者术前、术后血清CTSL的含量差异有统计学意义（p＜0.05）;复发患者的血清中CTSL及CC含量高于未复发患者（p＜0.05）;在卵巢恶性肿瘤患者术前血清中,CTSL的含量与肿瘤的临床分期、病理分级、淋巴结转移及残余灶的大小有关（p＜0.05）;CC的含量与淋巴结转移有关（p＜0.05）;血清CTSL、CC与卵巢恶性肿瘤的侵袭转移有关。血清CTSL对卵巢恶性肿瘤诊断的敏感性为72.7%,特异性为76.7%,阳性预测值为70.58%和阴性预测值为76.7%,准确率75.0%。单因素生存分析CTSL的含量与患者的预后相关（p＜0.05）,Cox比例风险回归模型分析显示残余灶大小是卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:血清CTSL含量在卵巢恶性肿瘤中异常升高,血清CTSL水平有可能作为诊断卵巢恶性肿瘤,判断有无复发及转移的生物学指标。CTSL基因真核表达质粒的构建与鉴定目的:构建CTSL基因的真核表达质粒并进行表达鉴定。方法:采用RT-PCR技术从人卵巢恶性肿瘤组织总RNA中逆转录CTSL基因的ORF全长,克隆到PMD18-T载体上;亚克隆至pcDNA3.1质粒,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和Western-blot检测CTSL基因mRNA和蛋白表达。结果:RT-PCR扩增CTSL ORF全长,成功克隆入PMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1质粒,重组阳性克隆经双酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正向插入pcDNA3.1质粒。RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达。结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌细胞中的作用提供了实验基础。CTSL基因介导的卵巢上皮癌细胞系侵袭转移的体外实验研究目的:通过体外实验研究CTSL基因与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系。方法:CTSL基因的真核表达质粒转染卵巢癌细胞HO8910,G418筛选,获得稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-blot技术证实CTSL基因转染成功。通过测定细胞生长曲线、克隆形成实验、细胞生长周期、细胞侵袭实验、细胞迁移实验和细胞黏附实验等了解CTSL基因转染后对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果:通过筛选建立了稳定转染细胞系HO8910-CTSL和HO8910-pcDNA3.1。细胞生物学实验显示:CTSL基因可促进卵巢癌细胞的侵袭转移,但是对卵巢癌细胞的增殖、细胞周期和黏附性影响不大。结论:体外实验进一步证明CTSL基因与卵巢恶性肿瘤的侵袭转移有关。CTSL基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定目的:构建CTSL基因的siRNA真核表达载体并鉴定。方法:根据GenBank数据库提供的CTSL基因核苷酸序列,设计并化学合成4对双链小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,瞬时转染卵巢癌细胞系A2780细胞,通过RT-PCR检测其对CTSL基因的沉默效果,从中筛选一对沉默效果最好的siRNA序列。并根据psilencer4.1载体插入片段设计要求,设计带有BamH1、HindⅢ粘性末端且能表达shRNA的寡核苷酸碱基对序列,退火后与psilencer4.1-CMV neo载体定向连接,测序进行鉴定,并通过RT-PCR验证其干扰效果。结果:成功构建CTSL的siRNA表达载体psilencer4.1-CMV neo-CTSL,经DNA测序证实与设计完全一致,并通过RT-PCR证明psilencer4.1-CMV neo-CTSL载体可沉默该基因。结论:成功构建了CTSL基因的siRNA真核表达载体,为下一步探讨CTSL基因对肿瘤细胞的作用奠定了基础。RNAi抑制CTSL介导的卵巢上皮癌细胞系侵袭转移的体外实验研究目的:研究RNA干扰CTSL基因对卵巢癌细胞侵袭转移的影响。方法:CTSL基因的siRNA表达载体转染卵巢癌细胞A2780,G418筛选,获得稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-blot技术证实CTSL基因干扰成功。通过测定转染细胞的生长曲线、克隆形成实验、细胞生长周期、细胞侵袭实验、细胞迁移实验和细胞黏附实验等了解CTSL基因干扰对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果:通过筛选建立了稳定转染细胞系A2780-CTSL、A2780-Control、A2780-psilencer,RT-PCR和Western-blot技术证实其能够沉默CTSL基因表达。细胞生物学实验显示:沉默CTSL基因后可以抑制卵巢癌细胞的侵袭转移,但对卵巢癌细胞的增殖、细胞周期和黏附性影响不大。结论:RNA干扰CTSL基因可以抑制卵巢癌细胞的侵袭转移,有可能成为卵巢恶性肿瘤基因治疗的新方法。

李峰^[2]（2006）在《ERβ对激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3和PC-3M增殖和凋亡的影响》文中进行了进一步梳理目的:探讨ERβ对激素抵抗性前列腺癌细胞株PC-3和PC-3M的增殖和凋亡的影响,为前列腺癌治疗研究提供新的思路与实验依据。方法:以基因重组技术构建pCDNA3.1-hERβ、pEGFP-C1-hERβ质粒和pGCsilencerTM U6/Neo/GFP-siRNA-ERβ质粒;应用真核细胞转染技术转染人前列腺癌细胞株PC3及PC-3M,观察并研究对细胞增殖、凋亡及侵袭能力方面的影响。结果:（ 1 ）通过酶切鉴定和测序证明pCDNA3.1-hERβ、pEGFP-C1-hERβ和pGCsilencerTM U6/Neo/GFP-siRNA-ERβ的重组质粒构建成功。（2）将pCDNA3.1-hERβ、pEGFP-C1-hERβ转染前列腺癌细胞PC-3和PC-3M,成功建立了高表达ERβ的细胞株;将pGCsilencerTMU6/Neo/GFP-siRNA-ERβ转染前列腺癌细胞PC-3和PC-3M,成功建立了ERβ沉默的细胞株。（3）生长抑制实验证明pCDNA3.1-hERβ对PC-3和PC-3M细胞增殖具有抑制作用;而转染pGCsilencerTM U6/Neo/GFP-siRNA-ERβ的细胞则无抑制作用。证实ERβ能明显抑制前列腺癌细胞的生长。（4）证实ERβ可诱导PC-3和PC-3M细胞凋亡;同时抑制了细胞增殖相关基因cyclinD1和抑制凋亡基因Bcl-XL、AKt和Survivin的表达;而上调了增殖抑制基因P21和促凋亡基因（caspase3、caspase9等）的表达。（5）基质胶浸润分析实验、酶谱分析实验表明ERβ可使前列腺癌细胞的侵袭力下降。结论:通过增加和降低ERβ在细胞中的表达,发现ERβ可抑制前列腺细胞PC-3和PC-3M的生长,促进其凋亡,降低其浸润特性。

靳玉兰^[3]（2003）在《人鼻咽癌恶性生物学行为相关基因的分析与克隆》文中研究指明α-甘露糖苷酶是蛋白质糖基化中一类重要的酶，与肿瘤发生发展的关系十分密切。由于本实验室克隆到一个新的人α-甘露糖苷酶基因（6A8），因此对其与肿瘤发生发展的关系作了研究。我们用反义技术抑制人鼻咽癌细胞株CNE-2L2中6A8 α-甘露糖苷酶的表达，建立了6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的克隆细胞株AS，用转导无关DNA（UN）或空载体（M）的细胞及野生型（W）细胞作对照，比较了AS细胞在体内和体外的恶性生物学行为。本论文工作的第一步是把细胞接种于裸鼠皮下，观察细胞的肿瘤性生长和所长肿瘤的肺转移，以确定6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制对CNE-2L2恶性生物学行为的影响。 细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的生长曲线表明，6A8 α-甘露糖苷酶表达低下的细胞（AS）的生长较对照组[转导空载体（M）、转导无关DNA片段（UN）及野生型（W）]细胞显着减慢。细胞接种后第8周末，W、M、UN与AS细胞所长肿瘤的平均重量分别为7.55±3.61、8.97±0.97、8.95±4.50、0.95±0.77克，所长肿瘤的肺转移率分别为60％、44％、56％、10％。以上结果表明，6A8 α-甘露糖苷酶表达低下的AS细胞的恶性生物学行为显着抑制。 这样，我就建立了恶性行为（生长、转移）不同的鼻咽癌细胞株：高恶性行为的W、M及UN细胞和低恶性行为的AS细胞。我首先用DDRT-PCR方法分析了AS细胞和W细胞间差异表达的基因。DDRT-PCR结果显示共有58条差异显示条带，其中45条在AS中高表达，而另外13条则在W中高表达。将差异表达的EST片段行DNA测序，将所得序列与GenBank的非重复序列（nr）及EST数据库以BLAST软件（Blastn）做比较，见其中23条EST序列与已知基因高度同源，故认为这些EST代表的是已知基因。另有8条EST虽找不到相应的已知基因，但藉同源EST拼接，拼接出了有开放阅读框的cDNA。剩余的27条EST则无同源的EST序列，无法拼接出相应的cDNA。 尽管电子拼接方法可拼接出cDNA，但它是否确实存在于组织中，首先要用Northern印迹检验。我挑选17条EST(其中包括10条已知基因和7条可同源拼接的

范德刚^[4]（2003）在《骨肉瘤转移相关基因筛选研究和BLCAP基因克隆、表达及初步功能研究》文中进行了进一步梳理恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病之一。随着医学研究的进步，人们在外科手术的基础上发展出化学治疗、放射治疗、免疫治疗等手段。虽然各种治疗方法都有一定的效果，但是都很难达到预期的目的，肿瘤转移仍然是临床治疗中最常见的无法解决的问题，往往就意味着治疗的失败。目前甚至没有很好的早期诊断肿瘤转移的方法。为了解决这个问题，研究者把重点集中在肿瘤转移的分子机制方面，试图通过研究参与肿瘤转移过程的各种分子，了解其中的相互关系，从而发展出更为有效的诊断和治疗手段。 骨肉瘤是骨科临床最常见的原发恶性骨肿瘤，恶性程度高，治疗困难，其早期转移是造成患者死亡的主要原因。对骨肉瘤发生和发展相关基因的研究，有助于提高对肿瘤转移机制的认识，促进诊断和治疗研究的深入。我们联合运用基因芯片技术和反义寡核苷酸技术研究具有不同转移能力的两种骨肉瘤细胞基因表达谱，筛选差异表达基因，探索筛选研究骨肉瘤转移相关基因的新途径。 常规培养本室建立的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607、高转移亚系SOSP-M。用Gibco公司的Trizol试剂一步法加以改进抽提培养的SOSP-9607及SOSP-M总RNA。 从提取的RNA逆转录合成cDNA第一链。在cDNA第一链合成中掺入荧光标记dUTP，用Cy3-dUTP标记SOSP-9607 cDNA，用Cy5-dUTP标记SOSP-M cDNA。探针乙醇沉淀后溶解在5×SSC+0.2％SDS杂交液中。 基因芯片和杂交探针分别置于95℃水浴中变性5min，立即将探针加在基因芯片上，盖玻片封片，置于密封舱内60℃杂交15～17h。揭开盖玻片，分别用2×SSC+0.2％SDS，0.1％×SSC+0.2％SDS，0.1％×SSC洗涤10min，室温晾干。 用ScanArray 3000扫描仪扫描芯片，提取基因表达的荧光信号强度值。 第四军医大学博士学位论文用内参照基因对 Cy3和＊ 的原始提取信号进行均衡和修正。用 ImaGene 3刀软件分析Cy3和＊ 两种荧光信号的强度和比值。原始数据作标准化处理，算出所有基固的RatiO值（CyslCy3）。筛选出RatiO大于2或小于0．5的数据项共 101项，再从此数据中找出具有同一 Gene ID号的成对差异基固，共门组22个数据项。这些数据所代表基固与两种探针杂交时表现出一定差异，上下调趋势一致，程度相近。说明骨肉瘤发生转移的过程中，相当数量的基因表达水平发生了不同程度的变化，部分基固参与细胞生长和分化、细胞周期调节、信号转导等过程。 在基因芯片筛选的基础上，我们设计了相应的反义寡核旮酸进行体外试验，探索基因表达水平改变与细胞生长特性之间的关系。当BRCAI和BLCAP的 ASODNs剂量为 10 p moMi时均可促进人骨肉瘤 SOSP9607细胞生长，自第M起，对细胞生长速度产生明显的影响（P＜0刀5）。 与对照组集落形成数（51土5）比较，BRCAI－ASODNS组的集落形成数（85上8）显着增加（P＜0刀1）；＊＊＊＊卜＊SO＊NS组的集落形成数（90士7）显着增加（P＜0刀1）。＊＊＊AI－＊SO＊Ns组与＊＊＊＊P．＊SO＊Ns组间无显着性差另IJ（P＞0．05）。 细胞周期检测结果，BRCAI－ASODNS组、BLCAP－ASODNS组与对照组相比，PI指数、S期上调，细胞增殖活性均增强。两种基因的 ASODNS对于细胞增殖活性有相似的促进作用。 SABC 法染色结果表明，BRCAI 蛋白定位于骨肉瘤细胞浆中；BRCAI－ASODNS作用后人骨肉瘤细胞SOSP－9607的BRCAI蛋白表达水平明显降低，染色由强阳性转为弱阳性。 BLCAP基因（又称为be10基固）是国外学者在研究侵袭性膀肤癌时发现的，编码一个分子量为10KD的蛋白，功能尚不清楚。初步研究表明其与细胞侵袭性相关，考虑可能是一种新的抑癌基固。我们在研究骨肉瘤转移相 4 第四军医大学博士学位论文关基因时发现，BLCAP基因在人骨肉瘤细胞内也有表达，并且在高转移亚系中表达水平明显降低。本研究克隆BLCAP基因，并重组原核、真核细胞表达质粒，为进一步研究BLCAP基固功能创造条件。 根据BLCAP基因序列设计特异性PCR引物，扩增BLCAP基因ORF（BLCAP基因 CDNA中的 255－508hp之间的 263hp 片段），在上、下游引物分别力。N EC。RI、h。I酶切位点。 抽提培养的SOSP习607总RNA。以总RNA为模板，OligOUT厂 为引物，在鼠莫洛尼白血病病毒（MMLV）反转录酶催化下合成第一链。以反转录产物作模板，PCR扩增目的片段。PCR产物大，J。约280hp，用低溶点琼脂糖凝胶电泳回收，Wizardm Minicolumn纯化。 将纯化回收的 PCR产物与 pGEM1 easy A体连接，连接产物命名为pGEMELCAP。转化JM109感受态细菌，随机挑取5个白色菌落扩大培养，提取质粒，EC。RI、XhOI双酶切鉴定。选择酶切鉴定阳性克隆，测序。pGEM－BLCAP质粒DNA序列坝定结果与已发表的BLCAP基因CDNA中的255－508hp之间的序列相同，证明BLCAP基固克隆成功。 逆转录病毒载体pCDNA3＊及重组pGEM－BLCAP均用设计酶切位点作ECORI、XhOI双酶切，?

二、Construction of Antisense RNA Expression Plasmid for u-PAR and Its Transfection to Highly Invasive PC-3M Cell Subclones（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、Construction of Antisense RNA Expression Plasmid for u-PAR and Its Transfection to Highly Invasive PC-3M Cell Subclones（论文提纲范文）

（1）组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究（论文提纲范文）

（2）ERβ对激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3和PC-3M增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）

（3）人鼻咽癌恶性生物学行为相关基因的分析与克隆（论文提纲范文）

（4）骨肉瘤转移相关基因筛选研究和BLCAP基因克隆、表达及初步功能研究（论文提纲范文）

四、Construction of Antisense RNA Expression Plasmid for u-PAR and Its Transfection to Highly Invasive PC-3M Cell Subclones（论文参考文献）

• [1]组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究[D]. 王素梅. 广西医科大学, 2008(10)
• [2]ERβ对激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3和PC-3M增殖和凋亡的影响[D]. 李峰. 吉林大学, 2006(10)
• [3]人鼻咽癌恶性生物学行为相关基因的分析与克隆[D]. 靳玉兰. 中国协和医科大学, 2003(12)
• [4]骨肉瘤转移相关基因筛选研究和BLCAP基因克隆、表达及初步功能研究[D]. 范德刚. 中国人民解放军第四军医大学, 2003(03)

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