一、泡球蚴感染BALB/c小鼠IgG亚类和细胞因子的动态观察（论文文献综述）
张小凡[1]（2020）在《细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA谱鉴定及作用于树突状细胞的功能与机制研究》文中进行了进一步梳理棘球蚴病又称为包虫病,是由棘球属绦虫的幼虫（棘球蚴）寄生于人和多种食草类家畜引起的一种人兽共患病,其主要寄生部位为肝脏和肺脏。包虫病严重危害人类健康和畜牧业生产,为我国重点防治的重大疾病。由细粒棘球蚴寄生引起的囊型包虫病,在我国广泛流行,受危胁人口数、患病数和发病率居全球首位。树突状细胞（dendritic cells,DC）是一类功能最强的专职抗原提呈细胞,可有效启动初次免疫应答,在寄生虫感染时决定机体免疫应答方向。髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressorcells,MDSC）和调节性 T 细胞（regulatoryT cells,Treg）是两群主要引起免疫抑制作用的细胞,两者在细粒棘球绦虫原头节感染小鼠的外周血、腹腔和脾脏中明显富集。DC和MDSC可诱导Treg的产生,且DC可由MDSC分化产生。研究发现,寄生虫可释放携带多种生物活性物质（蛋白质、脂质和核酸等）的外泌体,参与寄生虫-寄生虫的信息交流,寄生虫-宿主的相互作用,在寄生虫感染致病过程中起重要作用。寄生虫源外泌体含有大量的miRNAs,可被宿主细胞摄取,进而调控宿主的免疫应答。然而,DC和抑制性细胞群（MDSC和Treg）在细粒棘球蚴感染小鼠的原发感染病灶肝脏的动态变化情况尚不清楚;原头节源外泌体及其含有的miRNAs在细粒棘球蚴感染致病过程中发挥的作用及机制尚未见报道。本研究建立细粒棘球蚴感染小鼠模型,利用流式细胞术检测小鼠感染早、中、晚期（3、6和12个月）肝脏白细胞DC、MDSC和Treg的比例动态变化情况。采用超速离心获得细粒棘球绦虫原头节源外泌体样囊泡（protoscoleces derived exosome like vesicles,PSC-ELVs）和囊液源外泌体样囊泡（hydatid fluid derived exosome like vesicles,HF-ELVs）,进行高通量测序以及生物信息学分析,获得PSC-ELVs和HF-ELVs的ncRNAs（包括 miRNAs、lncRNAs 和 circRNAs）表达谱,对 PSC-ELVs 中含量前20的miRNAs进行筛选和鉴定,分析预测其潜在的靶基因,构建lncRNA-mRNA-miRNA调控网络,初步探索PSC-ELVs中最为丰富的miRNAs可能参与宿主的免疫调控和发病机制,为进一步研究这两种ELVs中miRNAs在寄生虫-宿主相互作用中的免疫调控功能提供理论基础。细粒棘球绦虫排泄分泌抗原（excretion-secretion antigens,ES）可调控DC的成熟和功能,影响炎症因子释放,调节Th1/Th2型免疫应答。外泌体是ES的重要组成部分,广泛参与核酸运输,细胞间物质交换和抗原递呈等。本研究通过将原头节源外泌体与骨髓来源的树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BMDC）共培养,分析其对BMDC表面MHCII分子和共刺激分子表达,以及细胞因子分泌的影响,探索原头节源外泌体及其含有的miRNAs对DC的功能及作用机制,为原头节源外泌体及其含有的miRNAs参与宿主免疫应答的作用提供理论及分子基础,也为包虫病临床诊断和基因治疗等研究提供新思路。一、细粒棘球蚴感染小鼠树突状细胞和免疫抑制细胞群比例动态变化研究建立细粒棘球蚴感染Balb/c小鼠模型,每只感染组小鼠腹腔注射2 000个原头节,对照组腹腔注射等量生理盐水。小鼠感染后3、6和12个月（感染早、中、晚期）收集肝脏白细胞,采用流式细胞术检测小鼠肝脏白细胞中DC、MDSC及其亚型M-MDSC、PMN-MDSC与Treg细胞的比例;动态分析感染小鼠肝脏DC和免疫抑制细胞群（MDSC和Treg）比例的变化。结果显示,小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中DC细胞比例分别为（5.27±0.55）%、（6.87±0.32）%和（18.5±0.64）%,对照组分别为（5.92±0.43）%、（5.99±0.12）%和（13.73±0.22）%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.05）。小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中MDSC 比例分别为（1.61±0.36）%、（5.68±0.69）%和（16.18±0.69）%,对照组分别为（2.19±0.42）%、（0.99 ±0.07）%和（4.18±0.84）%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.01）;小鼠感染后3、6和12个月后肝脏白细胞中M-MDSC 比例分别为（0.69±0.27）%、（5.30±0.72）%和（10.75±0.29）%,对照组分别为（0.42± 0.24）%、（0.69±0.02）%和（2.12±0.13）%,感染后 6 和 12 个月两组差异均有统计学意义（P均<0.01）;小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中PMN-MDSC 比例分别为（0.93 ± 0.23）%、（0.32±0.02）%和（5.14±1.03）%,对照组分别为（1.77±0.26）%、（0.28±0.05）%和（1.99±0.90）%,感染后3和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.05）。小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中Treg细胞比例分别为（3.35 ± 0.14）%、（6.24±0.38）%和（3.41±0.07）%,对照组分别为（3.48±0.46）%、（3.65±0.45）%和（3.12±0.12）%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.01）。小鼠感染原头节6和12个月后,肝脏白细胞中DC、MDSC与Treg细胞比例增加;其中MDSC比例变化更明显,以M-MDSC为主;同时可由M-MDSC分化形成的DC也明显升高,提示M-MDSC可能在小鼠感染细粒棘球蚴中后期发挥主要免疫抑制作用,且可能促进DC的产生。二、细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA表达谱分析通过对细粒棘球绦虫原头节（protoscoleces,PSCs）的培养液和绵羊可育囊的囊液（hydatid fluid,HF）进行超速离心获得PSC-ELVs和HF-ELVs。使用透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和Western blotting,对分离获得的两种外泌体进行鉴定,其大小,形态与外泌体一致,且含有特定的外泌体标记物。采用高通量测序分析了两种ELVs的ncRNAs（包括miRNAs、lncRNAs和circRNAs）表达谱,并利用GO和Pathway对PSC-ELVs中含量前20的miRNAs功能进行预测。在PSC-ELVs和HF-ELVs中,分别鉴定出1 18和58个miRNAs,两者共表达的miRNAs共有53个,其中PSC-ELVs特异表达65个,HF-ELVs特异表达5个。在PSC-ELVs和HF-ELVs分别鉴定出2 361和1 254个lncRNAs,其中两者共表达的lncRNAs共有1 004个,PSC-ELVs特异表达1 357个,HF-ELVs特异表达250个。PSC-ELVs中含量前20的miRNAs和circRNAs的表达量高于HF-ELVs中相应的miRNAs和circRNAs,而lncRNAs的表达量则低于HF-ELVs。通过荧光定量PCR检测,对miRNAs测序结果进行验证。此外,从PSC-ELVs含量前20的miRNAs中筛选出与宿主免疫应答有关的miRNAs,及其调控的lncRNAs 和 mRNAs,并构建了一个包含 5 个 miRNAs,41 个 lncRNAs 和 23 个mRNAs的ceRNA调控网络。PSC-ELVs含量前20的miRNAs的靶基因可能参与调控寄生虫感染过程中的炎症反应、MAPK级联反应和胶原分解代谢过程。此外,egr-miR-4989-3p 为 PSC-ELVs 和 HF-ELVs 中含量最高的 miRNA,与 egr-miR-277a-3p同属一个miRNA家族,具有相同的种子序列。本研究为首次鉴定获得PSC-ELVs和HF-ELVs中的ncRNAs谱,可能与宿主免疫应答和发病机理有关。这两种外泌体中含量丰富的miRNAs可能介导相关信号通路或与靶基因相互作用方式,在外泌体参与寄生虫-宿主相互作用中发挥重要的免疫调控作用。三、细粒棘球绦虫原头节源外泌体miRNA作用于树突状细胞的功能与机制研究通过将PSC-ELVs与BMDC共孵育,激光共聚焦显微镜观察发现PSC-ELVs可被BMDC内化摄取,qRT-PCR检测发现PSC-ELVs能将携带的miRNAs转运至BMDC中。通过qRT-PCR和ELISA分别检测处理后的BMDC细胞因子mRNA和蛋白质水平的表达,流式细胞术检测BMDC表面MHCⅡ类分子和共刺激分子表达水平,结果发现PSC-ELVs可有效诱导BMDC产生促炎性因子IL-6、IL-12、TNF-α、IL-β、IFN-γ和抑炎性因子IL-10,且大多数与LPS存在协同作用,上调细胞表面MHC Ⅱ分子和共刺激分子CD80、CD86、CD40、PDL1和PDL2的表达,这一结果提示PSC-ELVs可能携带某些毒力分子诱导BMDC成熟且往刺激型DC极化,呈现明显的促炎特性,可能产生Th1型细胞介导的免疫应答,有助于杀伤并清除入侵的病原体而保护机体。将miR-277a-3p和miR-4989-3p的mimic 和 inhibitor 转染 BMDC 后,qRT-PCR 检测发现,miR-277a-3p 和 miR-4989-3p诱导BMDC促炎性因子IL-6、IL-12和TNF-α的mRNA水平显着增加,抑炎性因子IL-10的mRNA水平显着降低,提示miR-277a-3p和miR-4989-3p可诱导BMDC产生炎性因子,往刺激型DC极化。miR-277a-3p和miR-4989-3pmimic诱导BMDC IGF1和NF-κB1的mRNA水平显着降低,NF-κB P65的mRNA和蛋白质水平显着增加,并增加其磷酸化水平,提示IGF1和NF-κB1是miR-277a-3p和miR-4989-3p潜在的靶基因,可能通过活化NF-κB P65并使其磷酸化,进而诱导促炎性因子产生。本研究为进一步明确原头节源外泌体及其含有的miRNAs调控宿主免疫应答机制及包虫病防治研究提供新思路和分子基础。
潘思宇[2]（2019）在《PD-1/PD-L1在两型肝包虫病中表达水平及临床意义的研究》文中指出目的:通过使用酶联免疫吸附法（ELISA）检测程序性死亡分子-1及其配体PD-L1在两型肝包虫病（Hepatic echinococcosis,HE）患者术前术后外周血血清中的表达水平,并利用免疫组化技术检测PD-1/PD-L1在肝泡球蚴（hepatic alveolar echinococcosis,HAE）病灶旁组织（病灶旁<2cm）及远端正常肝组织（病灶旁≥2cm）中的表达,综合分析PD-1/PD-L1在两型肝包虫病免疫逃逸中的作用机制,探讨其表达水平与肝包虫病病情进展之间的关系,为寻找新的肝包虫病动态检测策略提供新的依据。方法:研究对象共81例,其中实验组包括肝泡型包虫病（HAE）组24例及肝囊型包虫病（HCE）组27例,对照组（健康体检者）30例。收集上述实验组术前术后和健康对照组外周血血清样本及相应临床病例资料。采用ELISA法检测上述三组研究对象外周血血清中PD-1、PD-L1的表达水平,并分析PD-1、PD-L1与病例组临床指标之间的相关性。采用免疫组化技术检测上述肝泡型包虫病（HAE）组24例患者病灶旁组织（病灶旁<2cm）及远端正常肝组织（病灶旁≥2cm）中PD-1、PD-L1的表达。结果:1.在HAE病例组中,患者的部分肝功指标,如ALT、AST、DBIL等与正常对照组之间无差异（P>0.05）;而患者的年龄、白细胞、TBIL、IBIL与对照组有显着差异（P<0.05）。在HCE病例组中,患者的年龄、性别、民族、ALT、AST、DBIL、IBIL、白细胞与正常对照组之间无差异（P>0.05）;患者的TBIL与对照组差异显着（P<0.05）。2.PD-1在HAE患者术前及术后5-6、8-10、12天的PD-1浓度较健康对照组均明显升高（P<0.001）,但HAE患者术后15天以上的PD-1浓度虽较正常对照组高,但无统计学差异（P=0.786）。3.PD-L1在HAE患者术前、术后5-6、8-10、12天及术后15天以上的PD-L1浓度较健康对照组均明显升高（P<0.001）,随着术后时间的延长,PD-L1的浓度呈现下降趋势（P<0.05）。4.PD-1在HCE患者术前及术后5-6、8-10、12天的PD-1浓度较健康对照组均明显升高（P<0.001）,但HCE患者术后15天以上的PD-1浓度虽较正常对照组高,但无统计学差异（P=0.941）。5.PD-L1在HCE患者术前与术后5-6天PD-L1浓度,差异无统计学意义（P=0.105）。患者术前、术后8-10、12及术后15天以上的PD-L1浓度较健康对照组均明显升高（P<0.001）,6.HAE、HCE患者术前外周血清中PD-1、PD-L1的表达水平与患者的白细胞、肝功指标（ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL）等指标均无明显相关性（P>0.05）。7.PD-1在病灶旁组织的阳性表达率为75%,在远端正常肝组织中的阳性表达率为8%,两组对比差异有统计学意义（P<0.001）。PD-L1在病灶旁组织的阳性表达率为92%,在远端正常肝组织中的阳性表达率为20%,两组对比差异有统计学意义（P<0.001）。结论:PD-1、PD-L1在两型肝包虫患者外周血清中的表达水平较健康人群明显升高,且在患者术后PD-1、PD-L1的表达存在下降趋势,随着时间的延长,甚至可降至正常水平。泡型包虫病患者病灶旁组织中PD-1、PD-L1的表达高于远端正常肝组织。
雒艳萍[3]（2017）在《砂生槐种子生物碱抗包虫效应及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景包虫病是主要由棘球蚴或泡球蚴寄生于人体或动物体内引起的人兽共患寄生虫病,在全球广泛流行,严重危害人类健康和生命安全。目前,治疗包虫病以手术为主,但无法耐受手术或病情复杂而无法进行手术的患者,只能依赖药物治疗,而获批临床使用的药物仅有阿苯达唑和甲苯达唑两种,品种单一,疗效不理想,并且发现副作用多而严重,耐药现象日益增多。因此,亟需研发疗效明确、副作用小的抗包虫药物。从祖国传统医学的数千年治疗虫病的经验中寻找线索,是发掘抗包虫药物的一个重要途径。砂生槐为青藏高原特有植物,藏医记载其种子性苦、寒,具有治疗白喉、虫病、中毒症、消化不良等功效。本实验室在前期研究中发现砂生槐种子亲脂性总生物碱在体外具有杀灭细粒棘球蚴原头节活性,在体内可抑制小鼠继发性棘球蚴生长,提示砂生槐种子总碱中含有驱虫成分。但砂生槐种子在藏医中以水煎剂入药,亲脂性总碱水溶性差、抗虫效果弱,因此,本课题从砂生槐种子的水溶性成分中寻找有效的抗包虫成分并研究其抗虫机制。研究方法以乙醇为溶剂,采用热回流提取法分离砂生槐种子生物碱,以秀丽隐杆线虫为模型,对砂生槐种子的分离产物进行杀虫活性筛选。采用柱层析分离法,从杀虫活性较强的成分中提取极性较小的馏分和极性较大的馏分,TLC定性鉴定馏分的成分,通过秀丽隐杆线虫确定砂生槐种子的杀虫活性成分,并通过HPLC分析其主要化学成分。分离自然感染羊肝细粒棘球蚴原头节,在体外与砂生槐种子成分共同培养7天,观察原头节形态变化及存活情况,进一步确定砂生槐种子的杀虫活性成分。NIH小鼠腹腔注射细粒棘球蚴原头节建立慢性棘球蚴病模型,BALB/c小鼠腹腔注射泡球蚴建立慢性泡球蚴病模型,分别于感染后20 w和14 w用砂生槐种子杀虫活性成分灌胃治疗,剂量为100 mg/kg/day,治疗6 w后剖杀小鼠检测。剥离棘球蚴囊泡组织,称量湿重,常规HE染色;FCM分析脾脏CD3+、CD4+、CD8+和PD-1+的T细胞亚群;ELISA检测IFN-γ和IL-4水平;CFSE染色检测脾细胞增殖能力。以秀丽隐杆线虫为模式生物,检测砂生槐种子杀虫活性成分作用后秀丽隐杆线虫的运动行为能力、生殖能力、寿命、体长及ROS水平,反映其抗虫机制。体外培养肝细胞株Hep G-2细胞和Chang liver细胞,MTT法检测砂生槐种子杀虫活性成分对细胞生长的影响;BALB/c小鼠口服砂生槐种子杀虫活性成分（100 mg/kg/day）6 w后,检测血清肝肾生化指标和病理变化,评价砂生槐种子杀虫活性成分的毒副作用。Ⅲ型干扰素成员IL-28B与抗原EAMMH在0、3、6 w同时注射C57BL/6小鼠,10 w分离脾细胞,FCM分析CD4+CD25+Foxp3+Treg占脾淋巴细胞比例,ELISPOT检测分泌IFN-γ的T细胞数目,间接ELISA检测抗原特异性Ig G1和Ig G2c水平,反映IL-28B对Treg及免疫应答的调节作用,为其应用于包虫病治疗奠定基础。研究结果本课题从砂生槐种子获得4种提取物:非水溶性生物碱（E1）、水溶性生物碱（E2）、水溶性非生物碱（E3）和不溶性非生物碱（E4）。E1、E2、E3和E4的杀秀丽隐杆线虫的24 h-LC50分别为31.03 mg/ml、14.29 mg/ml、29.94 mg/ml和25.64 mg/ml,E2的LC50最低。从E2中提取到极性较小的馏分E2-a和极性较大的馏分E2-b。E2-a和E2-b杀秀丽隐杆线虫的24 h-LC50分别是9.06 mg/ml和36.24 mg/ml。TLC定性鉴定,E2-a含有苦参碱和槐果碱,E2-b含有氧化苦参碱和氧化槐果碱。苦参碱和槐果碱杀秀丽隐杆线虫的24 h-LC50分别是12.03 mg/ml和9.81 mg/ml。HPLC分析100μg/ml E2-a中苦参碱和槐果碱的含量分别为42.8μg/ml和25.7μg/ml。E2-a体外作用于细粒棘球蚴原头节后,虫体出现皱缩、一端或两端出现气泡、吸盘变形、顶突明显外翻等异常表现,活性降低。E2-b、E2、苦参碱、槐果碱在体外对原头节活性均有不同程度影响。杀原头节的72 h-LC50值由低到高依次是E2-a（0.35 mg/ml）、E2（0.45 mg/ml）、槐果碱（0.79 mg/ml）、苦参碱（1.16 mg/ml）、E2-b（2.12 mg/ml）,E2-a的LC50值最低。治疗小鼠慢性棘球蚴病的结果表明,E2-a组的棘球蚴囊泡组织湿重（8.40±2.93 g）明显低于阴性对照组（11.33±1.64 g）（p=0.042）;E2-a组的囊泡生发层与角皮层部分剥离,角皮层增厚,变得疏松,出现大量泡状物,失去典型的纹状结构,与外膜之间的界限变得模糊不清;E2-a组小鼠脾脏CD3+T细胞占脾淋巴细胞的比例（45.14%±23.93%）高于阴性对照组（14.74%±9.39%）（p=0.011）,且主要是CD4+T细胞比例（72.28%±3.63%）高于阴性对照组（50.33%±27.92%）（p=0.036）所致,CD8+T比例无明显升高或降低（p>0.05）;E2-a组小鼠PD-1+T细胞比例（9.92%±6.77%）显着低于阴性对照组（25.51%±13.53%）（p=0.009）,且CD4+PD-1+T细胞比例为5.73%±1.62%,明显低于阴性对照组（12.59%±6.35%）（p=0.023）,CD8+PD-1+T细胞比例为0.86%±0.35%,明显低于阴性对照组（2.77%±1.87%）（p=0.020）;E2-a组小鼠血清IFN-γ水平无明显变化,血清IL-4浓度平均为4.21 pg/ml,与阴性对照组（1.13 pg/ml）比较有升高趋势;E2-a组抗原刺激后脾细胞培养上清中IL-4浓度平均为5.75 pg/ml,与阴性对照组（3.10 pg/ml）比较有升高趋势;E2-a组小鼠脾细胞增殖能力无增高。治疗慢性泡球蚴病小鼠的结果表明,E2-a组小鼠的泡球蚴囊泡组织湿重为6.10±2.16 g,显着低于阴性对照组（11.25±1.73 g）（p<0.01）,平均降低囊重约5.15 g;E2-a组小鼠血清INF-γ水平无降低,IL-4浓度平均为48.46pg/ml,较阴性对照组（32.08 pg/ml）明显升高（p=0.032）。秀丽隐杆线虫的运动行为能力检测结果表明,8 mg/ml的E2-a作用24 h后,引起秀丽隐杆线虫的身体弯曲频率降为阴性对照组的1/3（p<0.01）;头部摆动频率平均为34.5次/min,明显低于阴性对照组（59.1次/min）（p<0.01）;咽泵频率平均为38.9次/min,低于阴性对照组（71.4次/min）（p<0.01）。E2-a能够抑制秀丽隐杆线虫的排卵功能,8 mg/ml的E2-a处理后的秀丽隐杆线虫每条虫排卵总数平均为205.2,明显低于阴性对照（248.8/虫）（p<0.01）,在第3天和第4天的排卵量分别平均为36.8/虫和13.2/虫,明显低于阴性对照组（分别为54.4/虫和28.2/虫）（p<0.05）,但AO染色未发现生殖细胞凋亡增多。8 mg/ml E2-a组线虫的寿命为9.1±4.1天,明显低于阴性对照组（13.0±4.6天）（p=0.021）。8mg/ml E2-a组线虫的体长平均为447.6 pixels,明显短于阴性对照组（486.8 pixels）（p<0.01）。E2-a无诱导ROS水平升高的作用。体外MTT实验证明,浓度为1 mg/ml的E2-a作用48 h后,Hep G-2细胞和Chang liver细胞的抑制率分别为29.03%和38.36%,因此低浓度E2-a对肝细胞株Hep G-2和Chang liver细胞的增殖有一定抑制作用。小鼠口服E2-a后检测血清肝肾生化指标,发现反映肝功能的指标谷丙转氨酶（38.333 U/L±4.726 U/L）和谷草转氨酶（150.000 U/L±35.763 U/L）较阴性对照组（谷丙转氨酶和谷草转氨酶分别为33.333 U/L±7.638U/L和139.667 U/L±30.172 U/L）略升高,反映肾功能的的指标肌酐（18.000μM/L±1.000μM/L）较阴性对照组（11.000±7.211μM/L）略升高,但均无统计学差异,其余指标无明显升高或降低,组织学检查未发现肝肾细胞出现明显改变。包虫感染中Treg增多,造成感染持续,故下调Treg是治疗包虫病的策略之一,本课题研究了Ⅲ型干扰素成员IL-28B对Treg的调节作用。结果表明,EAMMH-r Ad-m IL-28B组的Treg比例为0.17%±0.17%,显着低于非特异性对照EAMMH-r Ad-EGFP（0.76%±0.25%）（p<0.05）;EAMMH-r Ad-m IL-28B组小鼠分泌IFN-γ的脾细胞数较对照组无明显升高;与EAMMH组比较,EAMMH/r Ad-m IL-28B组的Ig G1水平有增高趋势,而Ig G2c水平降低（p<0.05）。研究结论砂生槐种子生物碱中抗虫活性较强的是低极性的水溶性生物碱E2-a,其主要化学成分为苦参碱和槐果碱（68.5%）。E2-a抗包虫的机制为损伤囊泡、诱导CD4+T细胞增多、下调T细胞表面负调节分子PD-1的表达、调节IFN-γ和IL-4,促进免疫功能。E2-a能够影响秀丽隐杆线虫行为能力,降低生殖能力,缩短寿命,影响发育。E2-a对培养的肝细胞株和小鼠的肝肾细胞有轻微毒性效应。IL-28B可下调Treg细胞,但不增强Th1免疫反应,尚需进一步研究其在包虫治疗中的作用。
庞明泉[4]（2016）在《多房棘球蚴抗原蛋白Emy162及TSP3的抗原表位的预测及鉴定》文中研究指明目的预测并鉴定分析多房棘球绦虫抗原蛋白Emy162及TSP3的B细胞和T细胞（Th1型、Th2型、Th17型）优势抗原表位,为后续抗多房棘球蚴多表位疫苗的研制奠定基础。方法1.Genbank获取Emy162、TSP3的氨基酸序列后通过生物信息学软件SOPMA预测二级结构特征,进一步通过在线软件IEDB、SYFPEITHI、Bcepred和ABCpred预测潜在的T细胞和B细胞表位。2.收集Emy162蛋白、TSP3蛋白、PBS分别免疫后的BALB/c小鼠得脾脏淋巴细胞,并用化学合成的抗原小肽进行刺激共培养。通过脾脏淋巴细胞增殖实验、培养上清与病人血清ELISA实验,鉴定出具有良好免疫原性的B细胞抗原表位。3.人工合成的T细胞抗原小肽刺激Emy162蛋白、TSP3蛋白、PBS致敏小鼠脾脏淋巴细胞,通过ELISA、ELISpot、流式细胞术等方法检测Th1、Th2、Th17型细胞因子的表达,鉴定出具有良好免疫原性的Th1、Th2、Th17型细胞抗原表位。结果1.Emy16、TSP3蛋白均存在潜在优势抗原性表位存在。Emy162的8个潜在优势B细胞表位为E7-13、E19-27、E28-36、E37-48、E78-83、E101-109、E112-121、E129-139;Emy162的6个T细胞潜在优势抗原表位为E7-13、E36-41、E80-89、E87-96、E97-106、E129-139。TSP3的7个B细胞潜在优势抗原表位分别为T18-33、T45-55、T53-63、T64-75、T80-90、T92-104、T110-122;TSP3蛋白的8个T细胞表位是T33-42、T45-55、T53-63、T68-77、T80-90、T92-104、T110-122、T134-144。2.Emy162、TSP3蛋白各B抗原表位的抗原性不同。Emy162的3个优势B抗原表位为E19-27、E112-121、E129-139;TSP3的3个优势B抗原表位为T18-33、T45-55、T110-122。3.Emy162蛋白各T抗原表位可诱导不同细胞因子的表达。E7-13、E36-41、E80-89、E129-139为Emy162的Th1型优势抗原表位;E36-41、E87-96、E97-106为Emy162的Th2型优势抗原表位;E36-41、E87-96、E97-106为Emy162的Th17型优势抗原表位。4.TSP3蛋白各T抗原表位可诱生不同细胞因子的表达。TSP3的优势Th1型抗原表位为T33-42、T45-55、T80-90、T110-122;TSP3的Th2型优势抗原表位为T45-55、T68-77、T92-104;TSP3的Th17型优势抗原表位为T53-60、T80-90。结论1.Emy162及TSP3具有良好的抗原性,并存在潜在优势抗原表位。利用生物信息学的方法预测分析出了Emy162的8个B细胞表位和6个T细胞表位,预测分析出TSP3蛋白8个T细胞和7个B细胞表位。2.Emy162蛋白具有3个优势B细胞表位、4个Th1型优势抗原表位、3个Th2型优势抗原表位、3个Th17型优势抗原表位。3.TSP3蛋白具有3个优势B细胞表位、4个Th1型优势抗原表位、3个Th2型优势抗原表位、2个Th17型优势抗原表位。4.鉴定出的各优势抗原表位,为后续研制用于免疫预防接种、诊断、治疗的高效多表位疫苗奠定了理论基础。
徐岩[5]（2014）在《CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞、CD11C+CD45RA+浆细胞样树突状细胞在泡球蚴感染小鼠中的动态变化》文中研究指明目的：观察泡球蚴（Em）感染Balb/c小鼠脾脏和淋巴结CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞（mDC）和CD11C+CD45RA+淋巴样树突状细胞（pDC）及脾脏DC分泌的IL-12、IFN-γ的动态变化，揭示树突状细胞在泡型包虫病发生中的作用与机制。方法：80只健康雌性Balb/c小鼠随机取20小鼠做感染率检测，其余60只随机分为实验组和健康对照组，每组30只，实验组腹腔注射活原头节悬液0.2ml/只（约含400个原头节），对照组腹腔注射等量生理盐水，分别于接种后2d、8d、30d、90d、180d、360d各处死5只小鼠，无菌取各组脾脏和淋巴结常规方法制备细胞悬液，用流式细胞术检测脾脏CD11C+CD45RA-mDC、 CD11C+CD45RA+pDC、淋巴结CD11C+CD45RA-mDC、CD11C+CD45RA+pDC百分含量；将脾脏DC进行纯化和培养，ELISA法检测培养上清中IL-12、IFN-γ的含量；结果：1)Em感染小鼠90d，可见明显泡球蚴囊泡组织，感染后360d，泡球蚴病灶遍布肝脏各叶；2)Em感染小鼠2d、8d、30d、90d、180d脾脏mDC、淋巴结mDC百分比显着高于对照组（P<0.01），其中在感染2d-90d过程中缓慢上升，90d达到峰值，之后迅速降低，至感染360d后，脾脏mDC百分比与对照组相比无明显差异（P>0.05），淋巴结mDC百分比显着低于对照组（P<0.01）；3)Em感染小鼠2d后，脾脏pDC百分比与对照组相比无差异性变化（P>0.05）；感染2d、8d后，淋巴结pDC百分比与对照组相比无明显差异（P>0.05）；感染30d后，脾脏、淋巴结pDC百分比急剧上升，90d达到峰值，之后缓慢下降，至感染180d、360d仍处于较高水平，显着高于对照组（P<0.01）；4)脾脏、淋巴结mDC/pDC比值在感染2d、8d、30d后高于对照组，在感染90d、180d、360d后低于对照组，各时段mDC/pDC比值变化均有统计学差异（P<0.05）。5)Em感染小鼠脾脏DC培养上清液中IFN-γ和IL-12水平始终高于对照组，有统计学差异（P<0.05），随泡球蚴感染时间呈先上升再下降趋势，90d达到峰值。结论：泡球蚴感染早期，mDC表达水平增高，促进细胞免疫应答，介导免疫保护，在抵抗早期泡球蚴的发生和发展和清除虫体中发挥作用，泡球蚴感染中晚期，pDC表达水平增高，诱导和维持机体免疫耐受，有利于包虫在体内的生长，使之慢性化；DC分泌的IL-12和IFN-γ随DC表达水平和功能发生变化，参与泡球蚴进入体内后的免疫过程，在增强宿主免疫力和抑制包虫生长过程中发挥重要的免疫调节作用。
祖力皮也.吐尔逊[6]（2013）在《细粒棘球蚴重组BCG-EgG1Y162疫苗的构建、表达及免疫特性研究》文中提出目的:构建细粒棘球绦虫重组BCG-EgG1Y162,并对其蛋白进行表达、分析以及免疫应答特性研究。方法:PCR扩增egG1Y162抗原编码基因;将该扩增产物定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV361中,构建重组质粒pMV361-EgG1Y162;利用电穿孔法分别将重组质粒pMV361-EgG1Y162和空质粒pMV361转化入BCG中,构建细粒棘球绦虫重组质粒BCG-EgG1Y162和BCG-pMV361。PCR扩增、酶切、测序鉴定后,45℃热诱导表达蛋白,SDS-PAGE鉴定。利用EgG1Y162的家兔多克隆血清免疫印迹法鉴定重组BCG-EgG1Y162蛋白。分别用细粒棘球蚴感染的犬血清和细粒棘球蚴病人的血清与重组BCG-EgG1Y162蛋白进行反应分析其抗原特性。分别用BCG-pMV361,rBCG-EgG1Y162,生理盐水免疫BALB/c小鼠,免疫前后取血,用ELISA法检测IgG1、IgG2a、IgG2b、IgE抗体水平;末次免疫后2周取脾淋巴细胞作体外培养,CCK-8法体外检测脾淋巴细胞增殖活性。结果:PCR成功扩增出360bp的egG1Y162抗原编码基因;双酶切证实egG1Y162抗原编码基因成功插入pMV361中;PCR及酶切证实rBCG-EgG1Y162构建成功;rBCG-EgG1Y162热诱导表达出相对分子质量约71kda处特异条带,而BCG-pMV361未出现目的条带;用EgG1Y162家兔多克隆血清免疫印迹分析发现rBCG-EgG1Y162的表达产物在相对分子质量（Mr）约为71KDA处有明显的目的蛋白表达条带,且能分别与细粒棘球蚴感染的犬血清,细粒棘球蚴病人的血清发生特异性免疫反应。免疫原性试验表明rBCG-EgG1Y162免疫后6周后小鼠IgG1,IgG2a,IgG2b抗体亚类水平高于对照组,与BCG-pMV361组和生理盐水组比较差异均有统计学意义（P均<0.05）;体外脾淋巴细胞增殖实验证实rBCG-EgG1Y162可引起细胞增殖反应,其增殖活性与BCG-pMV361组和生理盐水组相比差异具有统计学意义（P均<0.05）。结论:成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒BCG-EgG1Y162,能高水平的表达蛋白;rBCG-EgG1Y162可引起体外脾淋巴细胞增殖;rBCG-EgG1Y162能刺激机体产生高水平IgG1,IgG2a,IgG2b抗体,诱导细胞免疫和体液免疫应答,具有较好的免疫原性。本研究为包虫病预防性疫苗的研制奠定了理论及实验基础。
刘晓霞[7]（2013）在《细粒棘球蚴egG1Y162-1、egG1Y162-2疫苗诱导小鼠保护作用机制的研究》文中研究说明目的:在成功构建egG1Y162-1与egG1Y162-2重组蛋白,并确定其具有良好的抗原性与免疫原性的基础上,将疫苗egG1Y162-1与egG1Y162-2免疫BALB/c小鼠,并用细粒棘球原头呦攻击感染,研究免疫保护作用及其作用机制,为包虫病疫苗的研制提供新的候选分子。方法:（1）动物动物分组方案:选取140只小鼠随机分为A实验组（egG1Y162-1组）、B实验组（egG1Y162-2组）和C对照组（佐剂组）、D对照组（生理盐水对照组）,分别对其进行肢下注射egG1Y162-1、egG1 Y162-2、生理盐水+佐剂和生理盐水,之后进行三次加强免疫。4组均于末次免疫后两周（即第8W）用1000只细粒棘球蚴的原头蚴腹腔攻击感染。在第30w剖杀各组剩余小鼠,分离并称重细粒棘球坳囊,计算囊重抑制率。免疫保护力计算,免疫保护力计算公式:囊重抑制率=1-实验组平均包囊湿重/对照组平均包囊湿重×100%。对小鼠的免疫保护机制进行研究,体液免疫指标抗体水平的测定:从开始按不同的时间点0W（第一次免疫前）、2W（第二次免疫前）、4W（第三次免疫前）、6W（第四次免疫前）、8W（免疫后/感染前）、30W（感染后）,分别对各组小鼠采血,检验血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgE水平的变化;细胞免疫指标细胞因子水平的检测:在0W、8W、30W,分别分组对小鼠采血,进行血清细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-a、IL-4和IL-10的监测;用FCM检测小鼠感染后30W脾细胞CD4+和CD8+、亚群的变化,并检测CD4+CD25+T reg细胞、CD4+CD25+Foxp3+T reg细胞的改变。用CCK-8法检测小鼠8W和30W脾细胞增殖水平的改变;通过采用Annexin V-FITC试剂盒检测30W时脾细胞原液或用Con A刺激培养时细胞凋亡发生率。结果:（1）egGIY162-1、egG1Y162-2疫苗均可以诱导小鼠产生明显免疫保护力。（2）采集血清进行ELISA试验检测血清中抗体IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgE的变化,结果表明IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgE在免疫后实验组不同程度的上升,与对照组相比具有统计学意义。其中IgG、IgG2a、lgG2b和IgE在免疫后8达到最高水平,在感染后期下降;而 IgG1在免疫后升高后在感染后期达到最好水平。血清细胞因子IL-2、IFN-y、TNF-α、IL-4和IL-10的检测结果显示,IL-2和TNF-αα水平在第8W（免疫后）达到最高水平,在第30W（感染后）下降;IFN-γ、IL-4和IL-10在第8W（免疫后）出现增高趋势,在第30W（感染后）达到峰值。实验组与对照组差异均有统计学意义。FCM结果显示在第30W（感染后）实验组脾细胞CD4+和CD8+亚群出现明显升高,CD4+CD25+Treg水平降低。用CCK-8法检测小鼠8W（免疫后）和30W（感染后）显示疫苗组小鼠脾细胞增值情况均高于对照组,同组ConA刺激后增殖又高于疫苗刺激组,感染后同组同样刺激条件下脾细胞增殖水平出现下降。AnnexinV-FITC试剂盒检测脾细胞凋亡发生率,显示egG1Y162-1、egG1Y162-2疫苗组凋亡率低于对照组,而佐剂对照组和生理盐水对照组之间无明显差异。结论:egG1Y162-1与egG1Y162-2为极具应用潜质的疫苗候选分子。对疫苗egG1Y162-1与egG1Y162-2产生的免疫保护性可能机制有,抗体介导的体液免疫,IgG及其亚类IgG2a、IgG2b和IgE介导的体液免疫,在抗细粒棘球蚴感染过程中发挥重要作用;细胞免疫中,细胞因子水平变化显示Th1类免疫应答在疫苗免疫组的保护中占优势作用,有利于机体抵御细粒棘球呦的感染;疫苗egG1Y162-1与egG1Y162-2可诱导感染小鼠增强CD4+T的免疫应答作用,同时可以降低CD4+CD25+T reg的免疫抑制效应;疫苗egG1Y162-1与egG1Y162-2可通过增强感染小鼠的脾T淋巴细胞增殖能力,降低其凋亡抑制率,整体上提高脾T淋巴细胞的免疫功能。该疫苗候选分子的注入使得免疫抑制机制得到了有效地阻遏,有利于机体的抗寄生虫。
张丽娜[8]（2013）在《泡球蚴感染中Tfh细胞及其相关分子的作用研究》文中认为目的:研究Tfh细胞及转录因子Bcl-6、相关细胞因子CXCR5、ICOS在泡球蝴（Em）感染Balb/c小鼠中的变化特点,探讨其在泡球蝴感染中的作用。方法:将雌性BALB/c小鼠60只随机分成对照组和实验组,对照组经腹腔注射生理盐水,实验组经腹腔接种原头蚴制备泡球蚴感染小鼠模型。分别于感染后2、8、30、90、180和300天各处死5只小鼠,取肝脏组织和脾脏组织,通过HE染色观察肝组织病理变化;通过免疫组化检测泡球蝴感染小鼠肝脏、脾脏内CXCR5、ICOS、Bcl-6的表达部位及分布;取肝脏组织,通过实时荧光定量PCR（QRT-PCR）对泡球蚴感染小鼠肝脏中相关表型CXCR-5、ICOS和转录因子Bcl-6的检测,分析其表达水平;取脾脏组织和淋巴结,通过流式细胞术检测泡球蚴感染小鼠淋巴结和脾细胞中Tfh细胞亚群的变化;取血清,通过CBA法检测泡球蝴感染小鼠血清中相关细胞因子IL-4和IL-10的水平,通过ELISA法检测泡球蚴感染小鼠血清中相关抗体IgG1等亚类的水平;结果:1)泡球蝴感染小鼠中期可见明显泡球蚴囊泡,晚期囊泡中心出现坏死,不易与周围组织剥离,腹腔内粘连;2)HE染色后光镜下观察结果显示:实验组小鼠感染泡球蝴后早期肝组织结构未见明显异常改变,肝细胞边界清楚,排列整齐;感染中期可见大量炎性细胞浸润,出现胆管增生、肝库否细胞增生和肝细胞灶状坏死;感染晚期可见肝脏汇管区周围发生弥漫性纤维增生、纤维化,纤维组织将若干个肝细胞包绕;3)免疫组织化学结果显示:泡球蚴感染早期,CXCR5、ICOS和BCL-6均不表达或低水平表达;泡球蚴感染中晚期,随着小鼠体内肝脏泡球蚴的增大增多,CXCR5、ICOS和BCL-6的表达均显着升高（P<0.05）;4)QRT-PCR显示显示与空白组相比;在感染早期ICOS mRNA和CXCR5 mRNA均低水平表达,感染中期ICOS mRNA的表达显着增加（P<0.05）,感染晚期持续保持较高的水平;CXCR5 mRNA在感染中期表达显着升高（P<0.05）,在感染晚期持续保持较高的水平;5)流式细胞术检测结果显示与对照组相比:小鼠淋巴结Tfh细胞中,Tfh细胞比例在感染中、晚期显着性升高（P<0.05）;小鼠脾Tfh细胞中,Tfh细胞比例在感染中、晚期显着性升高;6)CBA检测结果显示与对照组相比:感染早期小鼠血清IL-4水平无显着变化,感染中期IL-4水平开始升高,随后均保持较高的水平（P<0.05）;7)ELISA检测结果显示与对照组相比:感染早期小鼠血清IgG1的水平维持在0.64pg/ml,感染中期IgG1的水平开始升高,随后均保持较高的水平（P<0.05）。结论:Tfh细胞在泡球蚴感染的早中晚期和外周淋巴器官有不同的变化特点,泡球蚴感染可引起小鼠肝脏纤维化改变,并随着病程时间的延长而加重;泡球蝴感染早期,肝脏组织结构未见明显异常改变,Tfh细胞及其细胞因子CXCR5、ICOS、BCL-6、IL-4也未见异常改变,血清IgG1的水平维持在0.64pg/ml;泡球蚴感染中期,小鼠肝脏组织、脾脏组织Tfh细胞比例均增高,Tfh细胞因子CXCR5、ICOS、BCL-6、IL-4比例均增高,可能参与泡球蚴感染的发展;泡球蚴感染晚期,小鼠肝脏组织、脾脏组织和淋巴结Tfh细胞比例增高,Tfh细胞因子CXCR5、ICOS、BCL-6、IL-4比例增高,共同参与泡球蚴感染的持续性发生发展;总之,Tfh细胞及转录因子Bcl-6,相关细胞因子CXCR5、ICOS表达量的增加可能促进了泡球蝴感染的持续性发生发展。
周必英[9]（2010）在《细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗构建及其免疫机制研究》文中指出目的本研究拟从细粒棘球绦虫（Eg）原头节中扩增出Eg95和EgA31抗原编码基因,再通过基因拼接法（Gene SOEing）将两个单基因融合,构建Eg95-EgA31融合基因,并将其定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,将该重组质粒电穿孔转化两歧双歧杆菌（Bb）以及大肠埃希菌BL21（DE3）,构建细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗,研究Eg95-EgA31融合基因在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达效率,探讨重组Bb-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后其免疫反应的动态变化和对Eg原头节攻击的保护力及其免疫机制,为囊型棘球蚴病（CE）的防治提供一种安全高效的新型疫苗。方法1.从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR分别扩增Eg95和EgA31抗原编码基因,然后采用Gene SOEing法剪接Eg95和EgA31,得到Eg95-EgA31融合基因,再将其定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,将该重组质粒电穿孔转化Bb,构建细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗;将该重组质粒电穿孔转化大肠埃希菌BL21（DE3）,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。2.为了研究重组Bb-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后不同时间点小鼠体内体液免疫和细胞免疫的变化,将重组Bb-Eg95-EgA31疫苗口服灌胃或鼻腔粘膜接种免疫BALB/c小鼠,免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20w用ELISA法检测血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平及脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖,流式细胞术（FCM）检测脾CD4+和CD8+ T细胞百分率。3.为了研究重组Bb-Eg95-EgA31疫苗对Eg原头节攻击的保护力及其免疫机制,将重组Bb-Eg95-EgA31疫苗皮下注射、肌肉注射、鼻腔粘膜接种或口服免疫BALB/c小鼠,免疫后8周,用50个Eg原头节经腹腔注射攻击,以空质粒、Bb或MRS作对照,25周后处死小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重减少率,ELISA法检测血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平及脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖,FCM检测脾CD4+和CD8+ T细胞百分率,Annexin V-FITC染色法检测脾细胞凋亡发生率。结果1.琼脂糖凝胶电泳证实Eg95（471bp）、EgA31（500bp）抗原编码基因和Eg95-EgA31融合基因（1016bp）扩增成功;双酶切证实重组质粒pGEX- Eg95-EgA31构建成功;PCR证实重组Bb-Eg95-EgA31疫苗构建成功;SDS-PAGE证实重组质粒pGEX-Eg95-EgA31在大肠埃希菌BL21（DE3）中经IPTG诱导后能够表达分子量为62.5KDa左右的重组Eg95-EgA31融合蛋白,IPTG诱导3～5h重组蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的18%,Western blot证实该融合蛋白具有特异的抗原性。2.动态观察表明:与0周未免疫小鼠相比,口服免疫组小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后8～10周、2～20周、2～20周、4～8周、6～12周和10周显着升高,分别在免疫后8、2、6、6、8和10周达最高水平;脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后2～16周、2～12周、2～6周和4～12周显着升高,分别在免疫后4、2、4和6周达最高水平;脾淋巴细胞增殖水平在免疫后4～10周显着升高,在免疫后6周达最高水平;脾CD4+ T细胞在免疫后4～10周显着升高,在免疫后6周达最高水平,CD8+ T细胞无明显变化。鼻腔粘膜接种组小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后4～10周、4～20周、2～20周、2～12周、4～12周和10～12周显着升高,分别在免疫后10、6、10、8、8和10周达最高水平;脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后2～8周、2～12周、2～8周和6～16周显着升高,分别在免疫后2、2、4和8周达最高水平;脾淋巴细胞增殖水平在免疫后4～8周显着升高,在免疫后6周达最高水平;脾CD4+ T细胞在免疫后4～8周显着升高,在免疫后6周达最高水平,CD8+ T细胞无明显变化。3.疫苗免疫加用Eg原头节攻击后发现,皮下注射组、肌肉注射组、鼻腔粘膜接种组和口服免疫组的囊重减少率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;与对照组相比,免疫组小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平显着升高,IgG3和IgE水平显着降低;脾IFN-γ、IL-12和TNF-α水平显着升高,IL-10水平显着降低;脾淋巴细胞显着增殖;脾CD4+和CD8+ T细胞显着增加;脾细胞凋亡发生率显着降低。鼻腔粘膜接种和口服灌胃是两种较好的免疫途径,且前者优于后者。结论1.通过RT-PCR成功扩增出Eg95和EgA31抗原编码基因。2.通过Gene SOEing法成功扩增出Eg95-EgA31融合基因。3.成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95-EgA31。4.成功构建了细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗。5.细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95-EgA31能在BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,表达效率为18%,且表达的重组Eg95-EgA31融合蛋白具有特异的抗原性。6.重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生有效的免疫应答反应。7.重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生有效的保护性免疫应答,从而对抗Eg原头节的攻击。其诱导的保护力以鼻腔粘膜接种和口服免疫组最强,而鼻腔粘膜接种组优于口服免疫组。
叶艳菊[10]（2010）在《细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗保护力及其免疫机制研究》文中进行了进一步梳理目的在构建细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗的基础上,提取转基因苜蓿叶蛋白,将叶蛋白提取液采用口服灌胃和鼻腔粘膜接种免疫BALB/c小鼠,动态观察其诱导的免疫应答的变化；将叶蛋白提取液采用口服灌胃和鼻腔粘膜接种免疫BALB/c小鼠后,再用Eg原头节攻击,研究该疫苗产生的保护力及其免疫机制。方法采用热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,用无菌双蒸水配成20μg/μl。同时提取转空质粒（pBT121）苜蓿叶蛋白和正常苜蓿叶蛋白作对照。为了动态观察细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c小鼠后诱导的免疫应答的变化,将88只雌性BALB/c小鼠随机分为2组,每组44只。口服灌胃组：每只小鼠灌胃100μl（约含1μg融合抗原）的转基因苜蓿叶蛋白提取液,灌胃前30 min先灌服5%的碳酸氢钠60μl,以中和胃酸；滴鼻接种组：每鼠接种10μl（约含0.1μg融合抗原）的转基因苜蓿叶蛋白提取液。以上各组每3d免疫1次,连续2个月。ELISA方法检测各组鼠免疫后不同时间（免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 w）血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平以及脾细胞体外培养原液及在受到EgAg或ConA（LPS）刺激后分别产生的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平；用MTT比色法检测脾细胞增殖水平；用FCM检测各组鼠免疫后不同时间（免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 w）脾细胞CD4+和CD8+亚群。为了研究细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c小鼠后抗原头节攻击产生的保护力及其免疫机制,将32只雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组8只。A组小鼠口服灌胃100μl的转基因苜蓿叶蛋白提取液（约含1μgEg95-EgA31融合抗原）,接种前30min用5%碳酸氢钠60μl对小鼠进行灌胃,以中和胃酸；B组小鼠滴鼻接种10μl上述提取液（约含0.1μg Eg95-EgA31融合抗原）；C组小鼠滴鼻接种10μl的转空质粒苜蓿叶蛋白提取液（不含Eg95-EgA31融合抗原）；D组小鼠灌胃100μl的正常苜蓿叶蛋白提取液,接种前30 min用5%碳酸氢钠60μl对小鼠进行灌胃,以中和胃酸。以上各组每3d免疫1次,连续2个月。4组均于末次免疫后第8w用Eg原头节攻击。在Eg原头节攻击感染后第24 w剖杀各组小鼠,分离并称重细粒棘球蚴囊,计算囊重减少率；用ELISA方法检测各组鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平；双抗体夹心ELISA试剂盒检测各组鼠脾细胞体外培养原液及在受到EgAg或ConA（LPS）刺激后分别产生的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平；用MTT比色法检测脾细胞增殖水平；用FCM检测脾细胞CD4+和CD8+亚群；用Annexin V-FITC试剂盒检测脾细胞原液或用ConA刺激培养时细胞凋亡发生率。结果动态观察发现口服组小鼠的血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在末次免疫后2～14周、2～14周、4～20周、6～12周、6～12周和4～16周升高,分别在末次免疫后4、4、6、8、8和10周达最高水平；脾T淋巴细胞增殖水平在末次免疫后4-10周升高,在末次免疫后6周达最高水平；脾CD4+和CD8+T细胞亚群分别在免疫后6～10周和4～12周升高,分别在免疫后6周和8周达高峰；脾细胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后4～6周、2～8周、2～6周和4～12周升高,分别在免疫后4、2、2和8周达最高水平。鼻腔接种组小鼠的血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在末次免疫后2～14周、2～18周、4～10周、6～14周、8周和6～12周升高,分别在末次免疫后4、4、6、12、8和6周达最高水平；脾T淋巴细胞增殖水平在末次免疫后4-12周升高,在末次免疫后6周达最高水平；脾CD4+和CD8+T细胞亚群分别在末次免疫后4-6周和4-10周升高,分别在末次免疫后6周和8周达高峰；脾细胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别在末次免疫后4～6周、2～10周、4～10周和6～16周升高,分别在末次免疫后6、4、6和6周达最高水平。疫苗免疫及原头节攻击后发现与D组相比,A组小鼠检获棘球蚴包囊质量降低,囊重减少率为64.10%,脾T淋巴细胞增殖水平升高,CD4+、CD8+亚群和CD4+/CD8+比值均升高,血清IgG、IgG2b和IgE水平升高,脾细胞上清液中的IFN-γ、IL-12和TNF-α水平升高,IL-10水平降低,脾细胞凋亡率降低。B组与D组相比,囊重减少率无显着差异,脾T淋巴细胞增殖水平升高,CD4+亚群和CD4+/CD8+比值升高,血清IgG、IgG2b和IgE水平升高,脾细胞上清液中IFN-γ和TNF-α水平升高,脾细胞凋亡率降低。A组血清IgG水平、脾细胞上清液中IFN-γ和IL-12水平、CD4+亚群百分比及脾T淋巴细胞增殖水平均显着高于B组,脾细胞凋亡率显着低于B组,但2组囊重减少率相比无显着差异。C组与D组相比结果无显着差异。结论1.动态观察表明细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液口服和滴鼻接种均可诱导免疫鼠产生有效的免疫应答。2.保护力实验提示细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液口服接种能诱导免疫鼠产生一定的保护力,Th1型免疫应答在其诱导的保护性免疫机制中起重要作用。
二、泡球蚴感染BALB/c小鼠IgG亚类和细胞因子的动态观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、泡球蚴感染BALB/c小鼠IgG亚类和细胞因子的动态观察（论文提纲范文）
（1）细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA谱鉴定及作用于树突状细胞的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 细粒棘球蚴感染小鼠树突状细胞和免疫抑制细胞群比例动态变化研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 建立细粒棘球蚴小鼠感染模型 |
| 2.4.2 肝脏白细胞悬液制备 |
| 2.4.3 流式细胞术检测肝脏DC细胞比例 |
| 2.4.4 流式细胞术检测肝脏MDSC及其亚型比例 |
| 2.4.5 流式细胞术检测肝脏Treg细胞比例 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 DC细胞在肝脏白细胞中的比例变化 |
| 3.2 MDSC及其亚群在肝脏白细胞中的比例变化 |
| 3.3 Treg细胞在肝脏白细胞中的比例变化 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA表达谱分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样本来源 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细粒棘球绦虫原头节和囊液分离 |
| 2.4.2 细粒棘球绦虫原头节体外培养 |
| 2.4.3 细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体分离和纯化 |
| 2.4.4 透射电镜分析(TEM) |
| 2.4.5 纳米粒径跟踪分析(NTA) |
| 2.4.6 Western blotting |
| 2.4.7 外泌体总RNA的提取和纯化 |
| 2.4.8 外泌体总RNA浓度和纯度测定 |
| 2.4.9 miRNA文库构建及测序 |
| 2.4.10 全转录组测序文库构建及测序分析 |
| 2.4.11 ceRNA调控网络构建 |
| 2.4.12 荧光定量PCR (qRT-PCR)分析 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体的分离鉴定 |
| 3.1.1 透射电镜分析(TEM) |
| 3.1.2 纳米粒径跟踪分析(NTA) |
| 3.1.3 Western blotting检测外泌体特有蛋白标志物 |
| 3.2 外泌体源miRNAs测序结果分析 |
| 3.2.1 样本测序结果基本情况 |
| 3.2.2 PSC-ELVs和HF-ELVs中保守miRNAs鉴定 |
| 3.2.3 PSC-ELVs和HF-ELVs中miRNAs数量和表达水平分析 |
| 3.2.4 靶基因预测及其功能富集和信号通路分析 |
| 3.2.5 荧光定量PCR (qRT-PCR)验证 |
| 3.3 外泌体源lncRNAs和circRNAs表达谱分析鉴定 |
| 3.4 mRNA-miRNA-lncRNA相互作用网络 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 细粒棘球绦虫原头节源外泌体miRNA作用于树突状细胞的功能与机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细粒棘球绦虫原头节源外泌体的分离鉴定:同第二章内容 |
| 2.4.2 原头节源外泌体总蛋白浓度测定 |
| 2.4.3 小鼠骨髓来源的DC体外培养 |
| 2.4.4 外泌体内化实验 |
| 2.4.5 miRNA功能获得性和缺失性研究 |
| 2.4.6 BMDC总蛋白制备 |
| 2.4.7 Western blotting |
| 2.4.8 ELISA |
| 2.4.9 BMDC总RNA提取 |
| 2.4.10 荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.4.11 流式细胞术检测 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PSC-ELVs总蛋白含量 |
| 3.2 BMDC纯度鉴定 |
| 3.3 BMDC摄取原头节源外泌体 |
| 3.4 原头节源外泌体转运miRNAs至BMDC |
| 3.5 转录水平原头节源外泌体活化BMDC |
| 3.6 原头节源外泌体诱导BMDC产生炎性因子 |
| 3.7 原头节源外泌体诱导BMDC表面标志物表达水平的改变 |
| 3.8 原头节外泌体源miR-277a-3p和miR-4989-3p诱导BMDC上调炎性因子表达 |
| 3.9 miR-277a-3p和miR-4989-3p潜在靶基因 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表文章及申请专利 |
| 附件 |
（2）PD-1/PD-L1在两型肝包虫病中表达水平及临床意义的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 对象与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 纳入标准 |
| 2.3 排除标准 |
| 2.4 研究方法 |
| 2.4.1 血液标本 |
| 2.4.2 组织标本 |
| 2.5 仪器和设备 |
| 2.5.1 主要使用的实验试剂 |
| 2.5.2 主要使用的实验仪器 |
| 2.6 具体实验步骤 |
| 2.6.1 血清标本采集及处理 |
| 2.6.1.1 血清标本前期准备 |
| 2.6.1.2 检测血清标本中PD-1、PD-L1 浓度 |
| 2.6.2 组织标本采集及处理 |
| 2.6.2.1 组织标本前期准备 |
| 2.6.2.2 HE染色 |
| 2.6.2.3 免疫组化技术染色 |
| 2.7 统计学方法 |
| 2.8 技术路线图 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 一般资料情况 |
| 3.2 ELISA实验结果 |
| 3.2.1 HAE患者术前术后及健康对照组外周血清中PD-1、PD-L1 的浓度 |
| 3.2.2 HCE患者术前术后及健康对照组外周血清中PD-1、PD-L1的浓度 |
| 3.2.3 HAE及HCE患者术前PD-1、PD-L1表达水平分别与各项临床指标间的关系 |
| 3.3 HE染色及免疫组化图片 |
| 3.4 免疫组化结果 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）砂生槐种子生物碱抗包虫效应及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 包虫病研究进展 |
| 1.1.1 包虫病的病原学与流行情况 |
| 1.1.2 包虫病的发病机制 |
| 1.1.3 包虫病的治疗现状及存在的问题 |
| 1.2 中药治疗包虫病进展 |
| 1.3 砂生槐种子的研究进展 |
| 1.3.1 砂生槐概述 |
| 1.3.2 砂生槐种子的药用价值 |
| 1.4 本课题立项依据 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 砂生槐种子水溶性生物碱的提取及杀虫活性筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 砂生槐种子乙醇提取部位中的各种成分 |
| 2.3.2 TLC鉴定砂生槐种子乙醇提取部位中的各种成分 |
| 2.3.3 砂生槐种子水提取物对秀丽隐杆线虫生存的影响 |
| 2.3.4 砂生槐种子乙醇提取物对秀丽隐杆线虫生存的影响 |
| 2.3.5 砂生槐种子乙醇提取部位中各成分对秀丽隐杆线虫生存的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 砂生槐种子水溶性生物碱的柱层析分离及杀虫活性筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 砂生槐种子生物碱E2的柱层析分离结果 |
| 3.3.2 砂生槐种子生物碱E2-a和E2-b的TLC鉴定结果 |
| 3.3.3 砂生槐种子生物碱E2-a和E2-b对秀丽隐杆线虫生存的影响 |
| 3.3.4 砂生槐种子生物碱E2-a与其主要单体成分对秀丽隐杆线虫活性影响的比较 |
| 3.3.5 砂生槐种子生物碱E2-a、E2-b、E2、苦参碱、槐果碱体外抗细粒棘球蚴原头节作用 |
| 3.3.6 HPLC分析砂生槐种子生物碱E2-a的化学成分 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 砂生槐种子生物碱E2-a的体内抗包虫作用及机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料和仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 砂生槐种子生物碱E2-a抗小鼠慢性细粒棘球蚴病效应及机制 |
| 4.3.2 砂生槐种子生物碱E2-a抗小鼠慢性泡球蚴病效应及机制 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 利用模式生物秀丽隐杆线虫研究砂生槐种子生物碱E2-a的抗虫机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料和仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 砂生槐种子生物碱E2-a对秀丽隐杆线虫行为的影响 |
| 5.3.2 砂生槐种子生物碱E2-a对秀丽隐杆线虫生殖的影响 |
| 5.3.3 砂生槐种子生物碱E2-a对秀丽隐杆线虫寿命的影响 |
| 5.3.4 砂生槐种子生物碱E2-a对秀丽隐杆线虫体长的影响 |
| 5.3.5 砂生槐种子生物碱E2-a对秀丽隐杆线虫ROS水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 砂生槐种子生物碱E2-a对肝细胞及小鼠肝肾功能的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料和仪器 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 砂生槐种子生物碱E2-a在体外对肝细胞生长的影响 |
| 6.3.2 砂生槐种子生物碱E2-a对小鼠肝肾功能的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 IL-28B对调节性T细胞的调节效应研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 实验材料和仪器 |
| 7.2.2 实验方法 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 rAd-mIL-28B和rAd-EGFP的病毒滴度测定结果 |
| 7.3.2 rAd-mIL-28B对小鼠脾细胞CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的影响 |
| 7.3.3 rAd-mIL-28B对小鼠免疫反应的影响 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 结论 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）多房棘球蚴抗原蛋白Emy162及TSP3的抗原表位的预测及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 多房棘球蚴抗原蛋白Emy162及TSP3的免疫优势表位的预测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 获取Emy162及TSP3蛋白的氨基酸序列 |
| 2.1.2 Emy162及TSP3蛋白质的二级结构特征预测 |
| 2.1.3 预测Emy162及TSP3抗原蛋白的T细胞抗原表位 |
| 2.1.4 预测Emy162及TSP3蛋白的B细胞抗原表位 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 获取Emy162及TSP3蛋白的氨基酸序列 |
| 2.2.2 预测的Emy162及TSP3蛋白质二级结构 |
| 2.2.3 预测所得Emy162及TSP3蛋白的T细胞抗原表位 |
| 2.2.4 预测所得Emy162及TSP3抗原的B细胞表位 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 多房棘球蚴抗原蛋白Emy162及TSP3的B细胞免疫优势表位的鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 抗原的获得 |
| 3.1.1.2 实验动物 |
| 3.1.1.3 实验仪器 |
| 3.1.1.4 实验动物及试剂 |
| 3.1.1.5 试剂配制 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 小鼠的免疫 |
| 3.1.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离[50] |
| 3.1.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验 |
| 3.1.2.4 抗原小肽与病人血清ELISA反应 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Emy162的B细胞抗原小肽刺激后淋巴细胞增殖反应的检测 |
| 3.2.2 TSP3的B细胞抗原小肽刺激后淋巴细胞增殖反应的检测 |
| 3.2.3 Emy162的B细胞抗原小肽与病人血清ELISA反应的检测 |
| 3.2.4 TSP3的B细胞抗原小肽与病人血清ELISA反应的检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 多房棘球蚴抗原蛋白Emy162及TSP3的T细胞免疫优势表位的鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 实验仪器 |
| 4.1.1.2 实验动物 |
| 4.1.1.3 免疫物 |
| 4.1.1.4 实验试剂 |
| 4.1.1.5 试剂配制 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 小鼠的免疫 |
| 4.1.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 4.1.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的培养 |
| 4.1.2.4 小鼠脾脏淋巴细胞因子ELISA检测 |
| 4.1.2.5 小鼠脾脏淋巴细胞因子ELISpot检测 |
| 4.1.2.6 小鼠脾脏淋巴细胞因子流式细胞术检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Emy162的优势T抗原表位鉴定 |
| 4.2.1.1 不同细胞因子ELISA检测筛选T表位 |
| 4.2.1.2 不同细胞因子ELISpot检测筛选T表位 |
| 4.2.1.3 流式细胞术对优势抗原表位的验证 |
| 4.2.2 TSP3的优势T抗原表位鉴定 |
| 4.2.2.1 不同细胞因子ELISA检测鉴定T表位 |
| 4.2.2.2 不同细胞因子ELISpot检测筛选T表位 |
| 4.2.2.3 流式细胞术对优势抗原表位的验证 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 不足和展望 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（5）CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞、CD11C+CD45RA+浆细胞样树突状细胞在泡球蚴感染小鼠中的动态变化（论文提纲范文）
| 导师评阅表 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 动物感染模型的建立 |
| 1.3 实验动物分组 |
| 1.4 标本采集 |
| 1.5 仪器 |
| 1.6 试剂 |
| 2. 内容和方法 |
| 2.1 流式细胞术检测树突状细胞亚群 |
| 2.2 ELISA法检测脾脏 DC培养上清 IFN-γ以及 IL-12含量 |
| 3. 统计方法 |
| 结果 |
| 1 泡球蚴感染小鼠大体观察结果 |
| 2 泡球蚴感染小鼠后脾脏 DC 亚群的动态变化 |
| 3 泡球蚴感染小鼠后淋巴结 DC 亚群的动态变化 |
| 4 泡球蚴感染小鼠后脾脏 DC 培养上清液中 IFN-γ和 IL-12 含量的动态变化 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
（6）细粒棘球蚴重组BCG-EgG1Y162疫苗的构建、表达及免疫特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株和血液标本 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 目的基因的PCR扩增 |
| 2.2 rpMV361-EgGlY162重组穿梭质粒的构建 |
| 2.3 重组质粒pMV361-EgGlY162的鉴定 |
| 2.4 重组BCG-EgGlY162的构建 |
| 2.5 重组BCG-EgGlY162的鉴定 |
| 2.6 重组BCG-EgGlY162的诱导表达 |
| 2.7 SDS-PAGE电泳 |
| 2.8 免疫印迹分析（western blot) |
| 2.9 动物实验 |
| 2.10 ELISA检测抗体亚类水平 |
| 2.11 统计方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（7）细粒棘球蚴egG1Y162-1、egG1Y162-2疫苗诱导小鼠保护作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 内容与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 接种物制备 |
| 1.3 实验动物模型制备 |
| 1.4 标本采集 |
| 2. 内容与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 实验技术路线图 |
| 3质量控制 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述（一） |
| 参考文献 |
| 文献综述（二） |
| 参考文献 |
| 导师评阅表 |
（8）泡球蚴感染中Tfh细胞及其相关分子的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 Em感染模型建立 |
| 1.2 标本的采集 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 常用溶液的配制 |
| 1.6 荧光定量引物设计和合成 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫组织化学 |
| 2.2 HE染色检查 |
| 2.3 QRT-PCR检测 |
| 2.4 流式细胞术检测 |
| 2.5 CBA:血清中的细胞因子检测 |
| 2.6 ELISA |
| 3 统计分析方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（9）细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗构建及其免疫机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文 细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗构建及其免疫机制研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗的构 建及其表达效率研究 |
| 第一节 细粒棘球绦虫 Eg95-EgA31 融合基因的构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗的构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗表达效率的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗免疫 BALB/c 鼠后免疫反应的动态观察 |
| 第一节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗免疫 BALB/c 鼠后 IgG 及其亚类和 IgE 的动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗免疫 BALB/c 鼠后脾 T 淋巴细胞增殖的动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗免疫 BALB/c 鼠后脾 T 细胞亚群的动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗免疫 BALB/c 鼠后脾细胞因子的动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗诱导的保护力及其免疫机制研究 |
| 第一节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗诱导的保护力观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗诱导 BALB/c 鼠脾 T 淋巴细胞增殖的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗诱导 BALB/c 鼠脾 T 细胞亚群变化的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗诱导 BALB/c 鼠脾细胞因子变化的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五节 细粒棘球绦虫重组 Bb-Eg95-EgA31 疫苗对 BALB/c 鼠脾细胞凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（10）细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗保护力及其免疫机制研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c鼠后免疫反应的动态观察 |
| 第一节 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c鼠后IgG及其亚类和IgE的动态观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c鼠后T淋巴细胞增殖的动态观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c鼠后T淋巴细胞亚群的动态观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四节 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c鼠后细胞因子的动态观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导的保护力及其免疫机制研究 |
| 第一节 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导的保护力观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导BALB/c鼠T淋巴细胞增殖的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导BALB/c鼠T淋巴细胞亚群变化的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四节 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导BALB/c鼠细胞因子变化的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五节 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗对BALB/c鼠脾细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述(一) |
| 文献综述(二) |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
四、泡球蚴感染BALB/c小鼠IgG亚类和细胞因子的动态观察（论文参考文献）
- [1]细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA谱鉴定及作用于树突状细胞的功能与机制研究[D]. 张小凡. 中国疾病预防控制中心, 2020
- [2]PD-1/PD-L1在两型肝包虫病中表达水平及临床意义的研究[D]. 潘思宇. 青海大学, 2019(04)
- [3]砂生槐种子生物碱抗包虫效应及机制研究[D]. 雒艳萍. 兰州大学, 2017(11)
- [4]多房棘球蚴抗原蛋白Emy162及TSP3的抗原表位的预测及鉴定[D]. 庞明泉. 青海大学, 2016(08)
- [5]CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞、CD11C+CD45RA+浆细胞样树突状细胞在泡球蚴感染小鼠中的动态变化[D]. 徐岩. 新疆医科大学, 2014(04)
- [6]细粒棘球蚴重组BCG-EgG1Y162疫苗的构建、表达及免疫特性研究[D]. 祖力皮也.吐尔逊. 新疆医科大学, 2013(05)
- [7]细粒棘球蚴egG1Y162-1、egG1Y162-2疫苗诱导小鼠保护作用机制的研究[D]. 刘晓霞. 新疆医科大学, 2013(05)
- [8]泡球蚴感染中Tfh细胞及其相关分子的作用研究[D]. 张丽娜. 新疆医科大学, 2013(05)
- [9]细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗构建及其免疫机制研究[D]. 周必英. 重庆医科大学, 2010(02)
- [10]细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗保护力及其免疫机制研究[D]. 叶艳菊. 重庆医科大学, 2010(03)