一、苏云金杆菌辅助蛋白基因p19和orf1-orf2对杀虫晶体蛋白Cyt1 Aa表达的影响(英文)（论文文献综述）
王帆帆[1]（2019）在《Bt杀虫蛋白原核表达及对异迟眼蕈蚊的杀虫活性》文中研究指明本试验对8株分离自江苏省紫金山土壤的野生苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）进行筛选后,得到1株对食用菌异迟眼蕈蚊（Bradysia difformis Frey）有较好杀虫活性的Bt菌株23-5。同时,对该菌株进行了形态鉴定、生理生化鉴定、16S rDNA鉴定和杀虫蛋白基因型鉴定等研究,并对该菌株含有的杀虫蛋白基因进行了原核表达,以期为食用菌Bt微生物农药的开发和应用提供理论依据。具体研究成果如下:1.通过胃毒法测定了8个Bt菌株对异迟眼蕈蚊的室内杀虫活性,结果表明8个Bt菌株中对异迟眼蕈蚊的校正死亡率最高可达84.48%（23-5菌株）,最低为43.11%。采用抑菌圈法测定了Bt菌株对平菇、毛木耳、茶树菇和双孢菇四种食用菌菌丝生长的影响,发现8个Bt菌株均减缓了四种食用菌菌丝生长速度,但最终菌丝仍然可以盖过Bt菌落继续生长。故选择校正死亡率最高的菌株23-5进行以下试验。2.对菌株23-5进行分类鉴定时主要采用形态鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定三种鉴定方法,同时采用PCR-RFLP法确定菌株23-5含有的杀虫蛋白类型。结果表明该菌株能够产生圆形或不规则形晶体,生理生化鉴定及16S rDNA鉴定结果均显示该菌株与苏云金芽孢杆菌最为接近。PCR-RFLP结果显示该菌株含有的杀虫蛋白基因型组合为cry4/10+cry11+cyt1+cyt2。所以确认该菌株属于苏云金芽孢杆菌（Bt）3.以NCBI上公布的与cry4B、cry10、cry11、cyt1、cyt2五种杀虫蛋白基因相关信息为依据,扩增菌株23-5中各杀虫蛋白基因片段,结果显示23-5中含有的cry4B、cry10、cry11、cyt1、cyt2基因序列的长度分别为1470bp、2043bp、1941bp、750bp、792pb。各基因的克隆载体和表达载体分别构建成功后,进行PCR验证和双酶切验证。各杀虫毒蛋白基因的生物信息学分析表明Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa和Cyt2Ba蛋白均为亲水性蛋白,Cyt1Aa蛋白为疏水性蛋白,分别得到其氨基酸组成、理化性质和保守结构域。4.将各杀虫蛋白基因构建成功的表达载体进行蛋白表达和纯化,IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE结果表明杀虫蛋白Cry4B、Cry10、Cry11主要存在于表达菌株的沉淀中,呈包涵体形式,恢复其生物活性需通过变复性的方式,再进行融合蛋白的Ni柱亲和纯化;目标蛋白Cyt2主要存在于上清液,呈可溶形式表达,可直接进行融合蛋白的Ni柱亲和纯化;目标蛋白Cyt1表达不明显。融合蛋白Cry4B、Cry10、Cry11和Cyt2表达的大小分别为70KD、84KD、88kD和70kD。5.分别提取各工程菌株的目标蛋白,用Brandford法测定蛋白浓度,进行各目标蛋白的室内毒力测定。各蛋白浓度为250 ng/mL时,蛋白Cyt2对异迟眼蕈蚊的杀虫活性最高,校正死亡率达70.18%;蛋白Cry4B、Cry10、Cry11对异迟眼蕈蚊的杀虫活性较低,三者之间无显着性差异,校正死亡率为33.33-35.09%。
李长慧[2]（2019）在《苏云金芽胞杆菌cry2类基因表达研究》文中研究说明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）Cry2类蛋白对多种鳞翅目害虫具有杀虫活性,并且与目前广泛应用于转基因作物中的Cry1类蛋白无交互抗性,是转基因抗虫作物重要的候选蛋白。目前,获得命名的cry2类基因共有94个,分为13类模式基因（cry2Aa-cry2Al,cry2Ba）。Cry2类蛋白具有序列相似性高,但是杀虫活性、杀虫谱及蛋白表达差异较大的特点。本研究重点围绕cry2类基因的表达特性开展研究,分析诱导温度、氨基酸序列差异、分子伴侣等因素对Cry2类蛋白表达的影响。具体包括本实验室克隆的五种模式的7个cry2类基因（cry2Aa9、cry2Aa17、cry2Ab4、cry2Ab29、cry2Ad2、cry2Ba2、cry2Ah1）,分别在大肠杆菌（Escherichia coli）和苏云金芽胞杆菌中进行了不同条件的表达,主要进展如下:1.分析了相同诱导条件下,不同cry2类基因在大肠杆菌中的表达情况。分别比较了20℃和30℃诱导下Cry2类蛋白表达量差异。其中Cry2Ah1蛋白的表达量均最高。通过比对Cry2Ah1蛋白与其它蛋白的氨基酸序列及三维结构差异,发现Cry2Ah1蛋白位于DomainⅡβ4与β5之间loop上的第355位缺失了1个氨基酸。对Cry2Ah1蛋白的增加氨基酸突变体Cry2Ahs（354位v变为s,355位添加p）、Cry2Ahv（355位添加p）进行相同条件诱导表达,这两种突变体的蛋白表达量显着低于Cry2Ah1蛋白,从而证实了Cry2类蛋白表达量与DomainⅡβ4与β5之间loop上的氨基酸数量密切相关。2.比较了在不同温度诱导下,在大肠杆菌中表达的7种Cry2类蛋白对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的杀虫活性,其中Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1四种蛋白对甜菜夜蛾有活性。在20℃诱导的条件下,蛋白浓度为100μg/mL时,Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1蛋白对甜菜夜蛾的体重抑制活性分别为42.74%、89.18%、87.02%、85.28%;在30℃诱导的条件下,蛋白浓度为100μg/mL时,Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1蛋白对甜菜夜蛾的体重抑制活性分别为0、43.72%、47.48%、70.54%;结果表明Cry2类蛋白的活性受温度影响,且Cry2Ah1蛋白的活性受温度影响较小。3.对实验室先前构建的Cry2Aa蛋白Bt表达载体pHT315-cry2AΔo1进行了改造。通过定点突变的方法将ClaⅠ和NcoⅠ酶切位点引入cry2Aa基因两端,利用同源重组的方法构建9种cry2类基因的Bt重组表达载体;导入Bt HD73-无晶体突变株后,9种蛋白均获得表达。比较了各重组菌对棉铃虫（Helicoverpa armigera）、小菜蛾（Plutella xylostella）、东方粘虫（Mythimna separata）、亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）的生物活性,除Cry2Aa9重组菌有活性外,其它重组菌均无明显活性。4.比较了Bt表达载体中分子伴侣ORF1、ORF2对Cry2类蛋白表达量及蛋白溶解性的影响。在分子伴侣ORF1、ORF2同时存在的情况下,Cry2类蛋白表达量显着高于ORF2单独存在,但是ORF1、ORF2同时存在对Cry2类蛋白在碱性溶液中的溶解性无显着影响。此进展为进一步改造Cry2类蛋白序列、提高蛋白表达及杀虫活性奠定了基础。
胡泉芳[3]（2014）在《苏云金芽胞杆菌杀虫晶体形成的分子机制研究》文中认为苏云金芽胞杆菌（Bacillus turiesnginis,简称Bt）是目前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂,其生物活性主要来源于杀虫晶体。研究Bt杀虫晶体形成的分子机制,对提高杀虫晶体蛋白的产量,增强Bt菌株杀虫毒力以及构建高效广谱的Bt工程菌株具有重要意义。有报道表明枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis,简称Bs）的同类残食行为能够影响芽胞的形成周期,因此本研究对Bt菌株是否存在同类残食行为开展了研究。根据Bt4.0718菌株基因组测序结果及生物信息学比对分析,发现该菌株含有Bs同类残食行为基因模块的同源序列,其中质粒上存在sdpRI-sdpABC模块,染色体上存在sdpRⅡ模块。同时发现Bt无晶体突变株XBU001的染色体上只含有sdpRⅡ模块。利用荧光染色技术及激光共聚焦显微镜观察发现,在对数生长期Bt4.0718菌株群体中只存在活菌体,而在稳定生长前期及稳定生长中期同时存在活菌体与死菌体,这些结果说明Bt4.0718菌株在培养过程中存在同类残食现象。在此基础上,本研究构建了 Bt无晶体突变株XBU001中sdpRⅡ基因模块的缺失突变株,扩增得到Bt4.0718菌株的sdpRI-sdpABC模块并克隆到pHT315载体,转化XBU001,为对同类残食行为基因模块进行初步研究奠定了基础。130～140 kDa的Cry1类原毒素非毒性C-端区域中富含半胱氨酸（Cys）残基,研究者普遍认为这些Cys残基对原毒素组装形成晶体具有重要作用,此外,在昆虫中肠蛋白酶水解激活的过程中被切除的部分N-端非毒性部分也包含了半胱氨酸残基。为了深入研究非毒性区域Cys残基的功能,本研究克隆了 Bt库斯塔克亚种（subsp.kurstaki）HD73菌株的cry1Ac基因,利用丝氨酸（Ser）扫描突变,对Cry1Ac原毒素非毒性区域的Cys进行单点突变及逐一叠加突变,将Cry1Ac原毒素非核心毒性区域的16个半胱氨酸（Cys）替换成丝氨酸（Ser）,并在本室无晶体突变株中XBU001中进行表达。相差显微镜观察所有重组工程菌株仍然能形成典型的菱形晶体,SDS-PAGE表明cry1Ac基因突变前后,所有突变重组工程菌株仍能表达130 kDa大小的目的蛋白。这些结果说明Cry1Ac原毒素非毒性部分的16个半胱氨酸残基的单点、多点突变并未影响其晶体的形成及表达。此外,表达野生和所有Cys残基叠加突变的Cry1Ac重组工程菌株对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的毒力无明显差异。本论文还研究了 Bt杰加森亚种（subsp.jegathesan）Cry30Ca的ORF2辅助蛋白对Cry11A表达的影响,通过基因工程重组技术,构建了置于cyt1AP/STAB 序列启动下cry11A单独、p20与cry11A、orf2-30Ca与cry11A的共表达载体。聚丙烯酰胺凝胶包埋技术结合质谱鉴定表明,辅助蛋白P20、ORF2-30Ca与Cry11A发生了共表达,相差观察分析表明3株重组工程菌株都能产生包涵体,SDS-PAGE分析ORF2-30Ca与Cry11A共表达时,其Cry11A的蛋白表达量仅为单独表达Cry11A或P20与Cry11A共表达时的1/2。对四龄致倦库蚊(Culex 的生测结果分析表明,ORF2-30Ca与Cry11A共表达时重组工程菌株的毒力也有所降低。这些结果均说明了 ORF2-30Ca不能辅助Cry11A的正确折叠,从而导致其形成的包涵体不稳定,在菌株内或菌株裂解后发生了降解。综上,本论文发现了 Bt4.0718菌株存在同类残食行为并对其基因模块功能进行了初步分析,为后续研究该行为对发酵周期的影响提供了借鉴基础。同时,Cry1Ac原毒素非毒性区域Cys残基的定点突变研究和ORF2-30C对Cry11A的辅助功能研究丰富了人们对杀虫晶体形成及表达调控机制的认识,为今后提高杀虫晶体蛋白表达量及构建高效Bt杀虫菌株提供了思路。
刘霜[4]（2014）在《苏云金芽胞杆菌伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白形成相关性的研究》文中指出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种生物杀虫剂,它的特点是高效且杀虫谱广,它的杀虫特性主要取决于在芽胞期产生的大量杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,ICPs）。目前,分子伴侣对芽胞杆菌中cry基因的影响主要集中于P19、P20、ORF1和ORF2的研究上,而groel、groes基因对cry基因的调控作用还不确定。本研究对Bt4.0718菌株-营养期（T1）,芽胞形成早期（T2）,芽胞形成中期（T3）和芽胞形成晚期（T4）的GroEL和GroES进行了免疫印迹分析,构建了重组表达质粒pET28a-GroEL和pET28a-GroES并转化E.coli BL21（DE3）,成功得到 GroEL 和 GroES 融合蛋白,HisTrap 亲和色谱纯化融合蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体,western blotting分析显示,在四个时期都检测到了 60KDa的GroEL和10 KDa的GroES蛋白,GroEL和GroES蛋白在菌株培养10h即有表达,20h达到高峰,而后逐渐减弱,并且GroEL和GroES蛋白的表达丰度明显低于内参蛋白30s核糖体蛋白的表达丰度。本文运用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌KCTF12菌株中的groel基因,构建了groel基因缺失突变株,通过相差显微镜观察结果显示,与原始菌株KCTF12相比,groel基因的缺失导致菌株的生长明显延迟,形成的伴胞晶体蛋白变小,说明groel基因对菌株的生长有重要的意义,而且其在伴胞晶体的形成过程中发挥一定的作用。为了进一步研究GroEL、GroES与伴胞晶体蛋白形成的相关性,本研究以Bt融合基因工程菌XBU001（1Ac-GFP）为研究对象,利用激光共聚焦扫描显微镜、多克隆抗体和荧光染料偶联的二抗对GroEL和GroES在细胞中的定位进行了连续时间段的观察。结果发现,细胞内GroEL、GroES蛋白的红色荧光信号明显,并且与晶体蛋白的绿色荧光信号出现重叠,在菌株生长的10-25h,红色荧光随着绿色荧光的增强而增强,25-35h绿色荧光继续增强直到达到最高峰,而红色荧光逐渐减弱,35-55h绿色荧光强度保持稳定,此时并未检测到红色荧光,上述结果表明,在Bt菌株体内GroEL、GroES蛋白与伴胞晶体蛋白可能发生了直接或间接的相互作用。采用生物信息学手段对GroEL、GroES蛋白相互作用蛋白进行了预测,发现在Bt细胞内与GroEL蛋白相互作用的蛋白主要有Gros、DnaK、Tuf、BT97272551、BT97274829、HrcA、FtsH、GrpE和SecA1,与GroES直接作用的蛋白主要有Grol、DnaK、FtsH、AcpP、BT97270237、RpsM、GrpE、BT97274313、GuaA 和 NrdR。本文首次利用免疫荧光技术研究Bt细胞内伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白之间的定位关系,为深入研究Bt体内伴胞晶体蛋白的形成过程、各代谢物之间的相互作用积累了有价值的实验资料。
尹学琳[5]（2013）在《苏云金芽胞杆菌的9个新型杀虫蛋白基因的克隆、表达和功能研究》文中研究表明由苏云金芽胞杆菌（Bt）的cry基因编码的杀虫晶体蛋白对多种昆虫、线虫,甚至癌细胞具有特异性毒杀作用、而对人畜无害,已被开发成为使用最成功的一种生物农药。但是,随着Bt杀虫剂和转Bt基因植物的不断推广和使用强度的不断增加,使得杀虫谱相对较窄、靶标生物可能产生潜在抗性、可用的杀虫基因资源较少等问题暴露出来。因此,发掘并克隆更多新型杀虫蛋白基因刻不容缓。本研究围绕新型杀虫基因的克隆展开了如下工作：1.利用高通量发掘平台克隆得到9个新型杀虫蛋白基因。通过我实验室构建的高通量测序新基因发掘平台,筛选出了9个新型杀虫蛋白基因。且它们氨基酸序列与已知蛋白的一致性均小于78%,已完成其出发菌株的确定及克隆。其中杀虫晶体蛋白基因3个；营养期杀虫蛋白基因6个。目前,3个杀虫晶体蛋白基因已得到苏云金芽胞杆菌命名委员会命名,分别是一级新基因cry73Aal和两个二级新基因cry29Bal和cry21Eal。2.杀虫晶体蛋白的表达。本研究表达的杀虫晶体蛋白分两部分：一部分是本实验克隆得到的3个Cry蛋白,其中,cry29Bal和cry21Eal分别在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中进行表达,均能形成近似圆形的晶体,并且产生与预计大小一致的蛋白。有意思的是基因cry73Aal,它与位于其下游的orf2在BMB171中共表达时,能形成菱形晶体并产生与预测一致的两个蛋白。但是分别单独表达时均不能形成晶体蛋白。初步判断orf2是一个新的辅助蛋白基因。另一部分,是本实验室已构建好Bt表达重组菌的8个cry （cry2385, cry67Aal, cry479, cry1719, cry2986, cry21Cal和cry21Dal）基因,通过SDS-PAGE胶检测和镜检观察,发现其都能形成和预测大小相近的晶体蛋白。3.杀虫晶体蛋白的杀虫活性测定。本研究选取上述新蛋白中的10个杀虫晶体蛋白（Cry29Ba1, Cry21Eal, Cry73Aa, Cry2385, Cry67Aal, Cry479, Cry1719, Cry2986,Cry21Caland Cry21Dal）进行活性研究。其中,选择Cry2986、Cry21Eal、 Cry73Aa1、Cry21Dal和Cry21Cal进行了秀丽小杆线虫的生测,发现均能产生生长抑制活性；选取了Cry2986、Cry29Ba1、Cry21Eal和Cry73Aa对鳞翅目的棉铃虫和小菜蛾进行了生物活性测定,均无生长抑制和致死活性。将10个蛋白对致倦库蚊进行了初步的活性测定,发现除了晶体蛋白Cry2385,其他均能对致倦库蚊产生不同程度的致死作用。让人感兴趣的是蛋白Cry2986,它与Cry8Ab的相似性达83%,却没有检测到对鳞翅目的棉铃虫和小菜蛾有毒性,而对秀丽小杆线虫有很强的致死和抑制活性。而目前发现的Cry8类蛋白还未检测出有对小杆目线虫毒性。所以,Cry2986的活性研究拓宽了Cry8类蛋白的杀虫谱。本研究克隆和进行杀虫活性研究的新基因,极大的丰富了杀虫蛋白基因的种类；为新型Bt生物农药的开发和转基因抗虫植物新品种的培育提供新的备选活性基因,为对抗害虫对Bt的抗药性提供了后备基因资源。
关鹏[6]（2013）在《苏云金芽胞杆菌MC28基因组完成图及其杀虫功能基因研究》文中认为苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis,Bt)MC28是从四川盆地沐川原始森林土壤中分离得到的,能在芽胞形成期产生大量球形伴胞晶体蛋白,对鳞翅目和双翅目昆虫具有明显的杀虫活性。前期研究采用PCR-RFLP （restricted fragment length polymorphisms, RFLP）鉴定方法从MC28中鉴定并克隆了5个杀虫晶体蛋白基因cry30Fa1、 cry53Ba1、cry54Aa1和cyt2Aa3),其中cry54Aa1编码蛋白对棉铃虫Helicoverpa armigera, Lepidoptera)、甜菜夜蛾（Laphygma exigua, Lepidoptera）和伊蚊（Aedes aegypti, Diptera）具有特异的杀虫活性；cry30Fa1编码蛋白对水稻褐飞虱（Nilaparvata lugens, Homoptera）具有特异的杀虫活性。为了研究MC28的基因组结构和进化特点,我们采用Illumina GA Ⅱ测序技术对MC28菌株进行全基因组测序。全基因组测序获得原始reads并过滤得到18,324,961个双末端reads,其对基因组的覆盖度达到451倍。采用SOAPdenovo组装软件将大约97.13%的reads组装成113个scaffolds。通过PCR、长片段PCR扩增以及构建Fosmid文库等策略对Scaffold内部和scaffold之间的gaps进行补洞,最终获得大小为6.68Mb的基因组完成图。利用Glimmer3.02对Bt MC28全基因组进行基因的预测,然后使用blast软件,将预测得到的蛋白序列与NR库进行比对,选择最好的比对结果作为相对应蛋白的注释,最终,MC28基因组总共注释得到6,555个蛋白。采用perl+SVG工具对Bt MC28和BtCT43及Bt YBT-020分别做共线性分析,结果表明：MC28与CT-43及YBT-020具有非常相似的基因组结构和共线性关系。采用MEGA和SplitsTree软件分别对Bt MC28和其它相关菌株构建系统发育树,两个结果均表明：Bt MC28菌株同其它Bt菌株在进化上距离较远,而是同Be Rock3-28、Bc Rock4-18、Bc Rock1-3和Be Rock3-29处在一个独立的分支上Bt MC28全基因组由8个环状复制子构成（1个染色体DNA和7个内生质粒）,总长为6.68Mb。其中环状染色体DNA长度为5,414,461bp,编码5,279个预测的开放阅读框（ORFs）,染色体DNA的G+C的百分含量为35.41%；7个环状内生质粒分别为pMC8、pMC54、pMC95、pMC183、pMC189、pMC319和pMC429,这些质粒共编码1,278个预测的开放阅读框（ORFs）,其G+C的百分含量在32.11%和34.78%之间。Bt MC28基因组共编码74个tRNA和45个rRNA。通过Bt MC28全基因组测序,我们从中发现了3个编码杀虫晶体蛋白基因的质粒,而且从这些质粒上发现了6个新型的杀虫晶体蛋白基因分别为cry54Ab1、cry68Aa1、cry69Aa1、cry69Aa2、cry70Ba1和cyt1Da1,至此在Bt MC28菌株中共得到11个新型杀虫晶体蛋白基因。其中质粒pMC189上共携带了7个杀虫晶体蛋白基因分别为cry30Fa1、cry53Ab1、cry54Aa1、cry54Ab1、cry68Aa1、, cyt1Da1和cyt2Aa3；而质粒pMC95上共携带有3个杀虫晶体蛋白基因分别cry4Cc1、 cry69Aa1和cry70Ba1;质粒pMC183上仅含有一个与cry69Aa1同源性为96.2%的杀虫晶体蛋白基因cry69Aa2。cry68Aa1、cry70Ba1和cyt1Da1的长度分别为2,511bp、2,427bp和1,527bp。为了研究这三个基因编码蛋白的杀虫活性,我们通过PCR扩增将这三个基因分别插入到原核表达载体pET-28a中,再转入到原核表达感受态细胞BL21（DE3）pLysS中,通过IPTG诱导表达,cry68Aa1, cry70Ba1和cyt1Da1基因分别产生约95kDa、90kDa和60kDa的表达产物,这与其预测表达蛋白的大小一致。生物活性测定结果表明：Cry68Aa1和Cry70Ba1均只对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有杀虫活性,其LC50分别为20.16μg/ml（95%的置信区间为16.34-35.72μg/ml）和30.22μg/ml（95%的置信区间为27.15-36.53μg/ml），而两者对鳞翅目的棉铃虫和双翅目的蚊虫无杀虫活性；Cyt1Da1对所测的昆虫均无杀虫活性。cry69Aa1基因全长为3,651bp,编码1,216个氨基酸,其预测编码蛋白大小约为137.1kDa,与已知的Cry4Ba蛋白的同源性最高,但仅为39%。比较结果表明：Cry69Aa1和已知大分子量的Cry蛋白均含有8个保守区域（见图5-1）,因此,Cry69Aa1蛋白属于大分子量Cry蛋白中的一类新型Cry蛋白。为了研究cry69Aa1基因编码蛋白的杀虫活性,我们将扩增得到cry69Aa1全长基因插入到穿梭载体pSTK中,再转入到Bt无晶体突变株HD73-中。重组菌株的扫描电镜（SEM）观察结果表明：cry69Aa1在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,能够形成大量的球形伴胞晶体。生测结果表明：重组菌株的芽胞晶体混合物对双翅目的致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）幼虫具有明显杀虫活性,其LC5o为23.7μg/ml,95%的置信区间为20.5-26.4μg/ml。cry54Ab1操纵子是由两个相同编码方向的ORFs组成的,第一个ORF是与ory54A类似的cry基因,长度为2,232bp,其编码743个氨基酸,预测编码蛋白分子量84.5kDa,根据编码蛋白的同源性,这个cry基因被命名为cry54Ab1;第二个ORF位于cry54Ab1的下游,两者之间被一个长67bp的非编码区所间隔,这个ORF在本研究中暂命名为orf2基因,该基因长1,524bp,编码503个氨基酸,其预测蛋白分子量为58.2kDa。为了研究cry54Ab1操纵子的杀虫活性,我们将cry54Ab1基因、orf2基因以及完整的cry54Ab1操纵子通过PCR扩增后分别插入到穿梭载体pSTK上,再转入到Bt无晶体突变株HD73-中表达。重组菌株的扫描电镜观察表明：当完整的cryS4Ab1操纵子在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,能够形成大量的球形伴胞晶体；当cry54Ab1基因或orf2基因单独在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,均不能形成伴胞晶体。SDS-PAGE电泳分析结果表明：完整的cry54Ab1操纵子在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,两个ORFs均能够大量表达,然而当cry54Ab1基因和orf2基因单独表达时,两个基因的表达量非常低,尤其是orf2基因几乎不表达。另外生测结果表明：完整的cry54Ab1操纵子和cty54Ab1基因的表达产物均对双翅目的致倦库蚊有杀虫活性,但是完整的cry54Ab1操纵子表达产物的杀虫活性是cry54Ab1基因单独表达时的杀虫活性的10倍之多。由以上结果可知,orf2基因的表达不仅能够使Cry54Ab1蛋白形成球形伴胞晶体,而且能够提高Cry54Ab1蛋白的杀虫活性。
张彦蕊[7]（2012）在《苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究》文中提出蛴螬是金龟子幼虫的总称，是地下害虫中最大类群，也是危害最大、造成损失最严重的种类。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前研究最多、应用最广的昆虫病原微生物。由河北农林科学院植保所分离的HBF-18菌株对大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）与暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）有较好杀虫活性，本实验室从中克隆了对暗黑鳃金龟与大黑鳃金龟都有活性的cry8Ga1基因。然而，cry8Ga1基因的表达产物杀虫活性与出发菌株（HBF-18）相比，有较大的差别，对大黑鳃金龟、暗鳃金龟的活性比出发菌株分别降低50倍与70倍。在本实验室克隆的其他对蛴螬有活性的cry8类基因则没有这种现象。由此推测HBF-18菌株中除了含有cry8Ga1基因外，还可能含有其他新的杀虫基因。但是通过传统的鉴定方法我们没有鉴定出来新的杀虫基因，本研究在菌株基因组测序的基础上，对HBF-18菌株中可能含有的新的杀虫基因进行发掘，克隆了3个新的基因，并对其表达产物进行了生物活性的测定和增效研究，具体进展如下：本研究在前期基因组测序的基础上，利用生物信息学分析，发现了三种新的杀虫基因。从HBF-18菌株中分别克隆了cry8-like、vip1、vip2基因。其中cry8-like基因长度2214bp，具有完整的阅读框架，编码738个氨基酸，与Cry8Db氨基酸序列相似性最高，达到51%，包含了完整的Cry毒素活性区所必需的三个结构域；在cry8-like基因上游存在SigA、SigD、SigE转录因子的结合位点及RBS序列，在其下游存在两个反向重复序列。该基因是一个完整的、不同于一般3.5kb的Bt cry8类基因。vip1全长基因2634bp，编码878个氨基酸，推导分子量为98.1kD，与Vip1Ba氨基酸序列相似性最高，达到76%，Vip1蛋白N端1-31位氨基酸为信号肽序列。vip2全长基因1386bp，编码462个氨基酸，推导分子量为52.6kD，与Vip2Ac氨基酸序列相似性最高，达到88%，Vip2蛋白N端1-30位氨基酸是其信号肽序列。vip2基因位于vip1基因上游，二者ORF间仅相差7个碱基；在vip2基因上游存在SigB、SigG转录因子结合位点，在vip1下游存在一个反向重复序列。反转录PCR结果显示上述基因在原始菌株HBF-18中能够正常转录。在大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株中成功表达了vip1、vip2、cry8-like基因，SDS-PAGE分析结果显示vip1基因表达约98kDa的蛋白，vip2基因表达约52kDa的蛋白，cry8-like基因表达约75kDa的蛋白。为了在Bt中表达cry8-like基因，本研究利用重叠PCR技术在cry8-like基因末尾加上了一段cry8Ea基因的3′末端序列，使其成为3528bp的杂合基因cry8X。将vip1、vip2、cry8X基因分别转化Bt无晶体突变株HD73-中，成功表达了三种蛋白，Vip1蛋白约80kD，Vip2蛋白约40kD，Cry8X蛋白约133kD。将构建的含有vip1、vip2、cry8X基因的Bt工程菌分别命名为HDVIP1、HDVIP2、HD8X；电镜观察结果表明HD8X可以形成球形晶体。分别测定了HD8X、HD8G、HD8X+HD8G、HDVIP1+HDVIP2、HDVIP1+HDVIP2+HD8G等菌株或菌株组合对暗黑鳃金龟幼虫的杀虫活性。结果表明，HDVIP1+HDVIP2及HD8X菌株对暗黑鳃金龟幼虫有杀虫活性，其LC50分别为3.51×1011和6.66×1011CFU/g土壤，二者杀虫活性都比HD8G及HBF-18低。HDVIP1+HDVIP2+HD8G菌株组合预期LC50与实测LC50的比值为4.15，具有协同增效作用，HD8X+HD8组合预期LC50与实测LC50的比值为1.86，属于相加作用。对不同的菌株和组合进行差异显着性检验，结果显示HDVIP1+HDVIP2+HD8G菌株组合对暗黑鳃金龟幼虫杀虫活性与HBF-18相比差异不显着。因此，HBF-18菌株杀虫活性比HD8G高的原因是该菌株中vip1、vip2、cry8X这些基因表达产物提高了Cry8Ga的杀虫活性。此外，Cry8X蛋白对铜绿丽金龟具有较好的杀虫活性，对小菜蛾没有杀虫活性。综上所述，本研究鉴定和克隆了三个新的杀虫基因vip1、vip2和cry8X，并揭示了只含有cry8Ga基因的表达菌株HD8G和原始菌株HBF-18之间杀虫活性有显着差异的原因。本研究为蛴螬的生物防治提供了新的基因来源。
郑文[8]（2011）在《苏云金芽胞杆菌胶原酶基因colB1的克隆表达及其在Bt感染昆虫中的功能研究》文中认为苏云金芽胞杆菌（Bt）是世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂,在多种害虫的综合防治中发挥了重要作用。作为一种重要的昆虫病原菌,Bt可以产生许多毒力因子帮助其侵入宿主,从而抵抗不利环境并生长繁殖,这些毒力因子包括许多降解酶类和毒素,如磷脂酶C、溶血素、蛋白酶、胶原酶等。本文主要研究了苏云金芽胞杆菌来源的胶原酶ColB1在Bt感染昆虫中的功能作用。1.colB1基因的克隆、表达及活性鉴定从YBT-1520菌株中克隆得到colB1基因,其核苷酸长度2898 bp,编码965个氨基酸,预测分子量110 kDa。将colB1基因克隆到pET28a载体,并在大肠杆菌中超量表达。纯化的ColB1蛋白能在明胶平板上产生水解圈,以Ⅰ型胶原为底物,采用茚三酮显色法测得该蛋白的酶活力为27.2 U/mL,比活力为2709 U/mg。2.ColB1蛋白与Cry1Ac复配能增强Cry1Ac对棉铃虫的杀虫活性以棉铃虫幼虫为供试昆虫,采用混合饲料法和表面涂布法测定了ColB1蛋白对杀虫晶体蛋白Cry1Ac的增效作用。混合饲料法生测结果表明,高浓度的ColB1蛋白能增强Cry1Ac的杀虫活性。表面涂布法测定结果显示,混合ColB1蛋白浓度组的死亡率均大于等于单独Cry1Ac浓度组,且其增效作用更明显。3.BMB171中ColB1在Bt感染昆虫中的功能研究序列比对发现,colB1基因与已公布的苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171基因组中BMB171C0475的氨基酸序列一致性高达99%。首先通过RT-PCR和GFP转录融合方法证明colB1基因在BMB171中能够转录和表达,之后利用同源重组敲除BMB171中colB1基因。用突变体芽胞和Cry1Ac定量混合喂食棉铃虫幼虫,生测结果显示突变体芽胞与晶体蛋白混合感染时对棉铃虫的毒性比对照菌株低,但差异并不明显。将cry1Ac基因分别转入突变体BMB1242和对照菌株BMB171,直接用发酵液进行生物测定,结果显示突变体BMB1242-1Ac引起棉铃虫的死亡率明显比对照菌株低。因此,缺失colB1基因能够降低Bt对棉铃虫的毒力。本研究第二部分克隆来自cry1Ac基因的BtⅠ-BtⅡ启动子、SD序列以及终止子,并引入pET28a的His-tag和多克隆位点,在穿梭载体pHT304的基础上构建了一个苏云金芽胞杆菌表达载体pBMB1A。将cry1Ac以及具有非典型BtⅠ-BtⅡ启动子的cry2Ab、cry5Ba、cry6Aa、cry7Ba、cry55Aa六个基因装载到该表达载体上,显微镜检结果表明cry1Ac、cry5Ba、cry7Ba、cry55Aa均能形成正常晶体,SDS-PAGE结果也证实这四个重组质粒均能表达目的条带。同时,本实验选取Cry1Ac来考察His-tag标签对Cry1Ac杀虫活性的影响,生物测定结果显示重组菌株的LC50值与对照菌株相比无明显差异。因此,该载体可用于快速克隆表达不同类别的Cry蛋白。同时,我们利用ctc2基因启动子构建了另一个表达载体pBMBC2,并成功表达crylAc基因且能形成晶体。
杜立新[9]（2011）在《苏云金芽胞杆菌cry8E基因转录调控机制研究》文中指出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）因其高效、安全和对环境友好等特点而成为世界上应用最为广泛的昆虫病原微生物。它在形成芽胞的同时可以在细胞中积累形成规则形状的晶体,其主要成份是杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,ICPs）,并且在细胞裂解时随芽胞一起释放。在苏云金芽胞杆菌杀虫剂的生产过程中,这种伴胞晶体可以达到发酵产物干重的25%以上。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因表达调控的研究对于明确Bt产生大量晶体的机制并在此基础上提高其产量具有重要意义。本文在构建了sigH突变体和sigK突变体的基础上,研究了cry8E基因的转录调控机制,并在转录水平和翻译水平上比较了cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因启动子的活性。本研究采用同源重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株中sigH基因,构建了sigH基因缺失突变株HD△sigH。通过生长曲线测定表明突变体较出发菌株在对数生长期后期的生长速度较慢;扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变体丧失了形成芽胞和晶体的能力;SDS-PAGE分析表明突变体丧失了表达Cry1Ac蛋白的能力;利用启动子融合lacZ基因技术在sigH突变体中监测了cry1Ac基因启动子的转录活性发现sigH基因的缺失导致cry1Ac启动子在芽胞分化前的细胞中转录活性上升,但在芽胞期母细胞中的转录活性明显降低,这表明sigH基因以某种方式调控Cry1Ac蛋白表达。说明sigH基因为苏云金芽胞杆菌芽胞形成和Cry蛋白高表达所必需。采用同源重组技术在苏云金芽胞杆菌HD-73菌株sigK基因中插入卡那霉素抗性基因,构建了sigK基因插入失活突变体。通过生长曲线测定表明突变体较出发菌株在稳定期后期生长较慢;扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变体丧失了形成芽胞和晶体的能力;SDS-PAGE分析表明突变体中伴胞晶体蛋白的表达量明显低于出发菌株。利用载体pHT315携带sigK基因及其启动子在突变株中表达,所获得的遗传恢复菌株恢复了突变株产生芽胞和晶体的能力。利用启动子融合lacZ技术在sigK突变体中监测了cry1Ac基因启动子的转录活性发现sigK基因的失活导致cry1Ac启动子的在T8后的转录活性降低。以上结果证明sigK基因为苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,并影响伴胞晶体蛋白的产量。通过对cry8E基因所在的大质粒进行序列分析发现cry8E基因上游存在一个orf1,其序列与cry2A、cry9Ca、cry9Ec、cry11A和cry18A操纵子中的orf1基因有很高的相似性,生物信息学分析表明orf1基因下游也没有典型的转录终止结构,通过RT-PCR的方法证明cry8E基因与其上游orf1基因是共转录的,说明cry8E基因与其上游orf1组成操纵子共转录。通过构建orf1和cry8E的启动子Porf1和Pcry8E与lacZ的融合表达载体,测定β-半乳糖苷酶的活性发现Porf1和Pcry8E都有启动子活性,说明cry8E基因表达是由两个启动子区控制的,分别位于orf1基因上游和orf1基因与cry8E基因之间。在orf1和cry8E基因间隔区存在启动子活性,这在cry基因启动子中尚属首次报道。对两个启动子区进行生物信息学分析表明这个orf1的上游存在σE的识别位点,推测其可能受σE因子调控,而orf1与cry8E基因的间隔区序列存在σH的识别位点,推测其可能受σH因子调控;分别在相应的突变体中测定其转录活性发现Porf1在sigE突变体中丧失了β-半乳糖苷酶的活性,5′-RACE方法测定orf1基因的转录起始位点和启动子的-35区和-10区,并且发现orf1基因的-35区和-10区与σE因子识别序列高度相似,综合以上结果说明orf1的启动子受σE调控;而Pcry8E在sigH突变体中的β-半乳糖苷酶活性显着低于其在野生型中的活性,5′-RACE方法测定cry8E基因的转录起始位点和启动子的-35区和-10区,并且发现其与σH因子识别序列高度相似,综合以上结果说明cry8E的启动子受σH调控。说明cry8E操纵子有两个非重叠的启动子,分别受σE因子和σH因子调控。orf1基因缺失导致cry8E基因启动子的转录活性上升,同时可以提高Cry8E蛋白的表达量,通过将orf1基因重新导入缺失orf1基因的菌株中发现,其转录活性又可以恢复,说明orf1基因的存在会抑制cry8E基因的表达。同时发现orf1基因的互补序列存在启动子活性,初步推测有可能是sRNA存在,但是其功能还有待于进一步研究。为在转录水平和翻译水平比较cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因启动子的活性,构建了cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因启动子与lacZ基因的融合表达载体,测定β-半乳糖苷酶的活性发现,cry8E基因启动子的转录活性最高;构建了cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因启动子与cry1Ac基因的融合表达载体,SDS-PAGE分析发现cry1Ac启动子所表达的蛋白产量最高;扫描电子显微镜观察发现4种启动子均可以使Cry1Ac蛋白形成菱形晶体。高活性启动子的筛选可为更进一步地提高杀虫晶体蛋白的表达水平和今后构建高效广谱工程菌具有重要的指导意义。
刘廷辉[10]（2009）在《苏云金芽胞杆菌菌株Bt11和GS8的研究》文中认为苏云金芽胞杆菌（Bt）是目前世界上应用最广的杀虫微生物,苏云金芽胞杆菌的杀虫活性主要取决于其在芽胞形成过程中产生的杀虫晶体蛋白,从Bt菌株中分离克隆杀虫基因,将有效开发利用我国丰富的杀虫基因资源,缩小国内外在Bt杀虫基因基础研究领域中的差距,为工程菌和抗虫转基因植物的构建提供新的基因来源。本论文在系统研究对鳞翅目害虫高毒力Bt菌株Bt11和GS8生物学特性的基础上,围绕cry1Ia、cry1Ib和cry9Ea基因的分离、克隆、表达载体构建、杀虫活性测定以及杀虫机理等方面进行了一系列的研究,主要内容包括:对本实验室分离保存的Bt菌株Bt11和GS8进行了生物学特性研究。Bt11和GS8的生长速率与标准菌株HD-73和4Q7相当,Bt11形成菱形、球形和方形晶体,而GS8则形成菱形、球形和不规则形晶体。SDS-PAGE分析表明,Bt11晶体主要由130kDa、80kDa、35kDa等蛋白组成,菌株GS8晶体主要由130kDa、81kDa、60kDa等蛋白组成。PCR-RFLP基因鉴定结果表明,菌株Bt11中含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ia、cry2Ab和cry9Ea五种基因类型,而菌株GS8中含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ib、cry2Ab和cry9Ba五种基因类型。琼脂糖凝胶电泳分析表明,Bt11菌株含有5种质粒,GS8菌株含有4种质粒。形态学和生理生化反应分析表明,Bt11菌株与库斯塔克亚种（B.t subsp.kurstaki）完全一致,GS8菌株与东北亚种（B.t subsp. tohokuensis）相同。利用全长PCR方法,以Bt11质粒为模板扩增了cry9Ea和cry1Ia全长基因,以GS8质粒为模板扩增了cry1Ib全长基因,完成了DNA序列测定。cry9Ea基因编码区全长为3453bp,与已发表的五种cry9Ea相比序列相似性为99.51%99.86%,推测分子量为129.874kDa,等电点pI4.68,为弱酸性蛋白;cry1Ia基因编码区全长为2160bp,与已发表的13种cry1Ia相比序列相似性为96.94%99.91%,推测分子量为81.202kDa,等电点pI5.955,为弱酸性蛋白;cry1Ib基因编码区全长为2160bp,与已发表的2种cry1Ib相比序列相似性为99.54%和99.77%,推测分子量为81.372kDa,等电点pI6.215,为弱酸性蛋白。cry9Ea、cry1Ia和cry1Ib基因序列已在GenBank中登记,Accession number分别为EU887516、EU887515和EU677422,提交国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会后,分别被正式命名为cry9Ea6、cry1Ia14和cry1Ib3。分别构建了cry9Ea6、cry1Ia14和cry1Ib3基因的原核表达载体pET-9Ea、pET-1Ia和pET-1Ib,SDS-PAGE和Western blot分析表明,三者均在大肠杆菌BL21（DE3）中获得表达。蛋白可溶性分析表明,三种蛋白主要以包涵体形式存在。生物测定结果显示,Cry9Ea6对粉纹夜蛾和小菜蛾的初孵幼虫具有高毒力(LC50值分别为0.0639μg/mL和4.574μg/mL),Cry1Ia14蛋白对粉纹夜蛾、家蚕和小菜蛾初孵幼虫具有高杀虫活性(LC50值分别为2.0342μg/mL、0.0163μg/mL和0.0261μg/mL),对甜菜夜蛾和棉铃虫初孵幼虫具有较高杀虫活性(LC50值分别为184.7727μg/mL和70.90μg/mL),Cry1Ib3对小菜蛾初孵幼虫具有高毒力(LC50值为0.0763μg/mL)。将cry9Ea6、cry1Ia14和cry1Ib3全长基因分别插入E.coli-Bt穿梭载体pSXY422b,转化大肠杆菌SCS110和Bt无晶体突变株HD73（cry-）,经抗性筛选、DNA酶切分析和PCR检测,证实获得了重组表达载体pSXY-9EA、pSXY-1IA和pSXY-1IB。SDS-PAGE分析表明,cry9Ea6基因在受体菌HD73（cry-）中能正常表达130kDa蛋白,而cry1Ia14和cry1Ib3基因在受体菌HD73（cry-）中未检测到表达蛋白。利用等电点法提取晶体蛋白,生测结果表明,Cry9Ea6对粉纹夜蛾和小菜蛾的LC50值分别为0.0532μg/mL和1.2259μg/mL,高于E.coli中表达融合蛋白的生测结果(LC50值为0.0639μg/mL和4.574μg/mL)。将cry1Ia14克隆于表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中获得了高效表达,蛋白可溶性分析表明,Cry1Ia14蛋白主要以包涵体形式存在,通过亲和层析方法纯化了Cry1Ia14蛋白;提取并纯化了Cry9Ea6晶体蛋白,免疫家兔制备了Cry1Ia和Cry9Ea蛋白的多克隆抗体,经分析两抗体的最佳效价为1:10,000。经Trypsin消化的Cry9Ea6和Cry1Ia14对粉纹夜蛾初孵幼虫进行生物活性测定,结果发现Trypsin消化后的Cry9Ea6是原毒素杀虫活性的5倍左右,Trypsin消化后的Cry1Ia14是原蛋白杀虫活性的3倍左右。因此,推测消化后的65kDa和50kDa多肽是Cry9Ea6的活性毒素,38kDa是Cry1Ia14的活性多肽。Cry9Ea6和Cry1Ia14蛋白体内和体外分别处理围食膜,结果表明,Cry9Ea6蛋白能够降解粉纹夜蛾围食膜上44kDa和30kDa左右的蛋白,破坏了粉纹夜蛾围食膜结构的完整性,对甜菜夜蛾围食膜蛋白结构无明显的影响;Cry1Ia14蛋白对粉纹夜蛾围食膜和甜菜夜蛾围食膜结构的完整性均有一定破坏作用。以Cry9Ea6蛋白（5μg/头）饲喂粉纹夜蛾五龄幼虫,于6hr后围食膜降解,中肠结构变得不完整;而Cry9Ea6蛋白（5μg/头）饲喂甜菜夜蛾五龄幼虫,12hr后围食膜依然可见,中肠壁略变薄,无太大变化。以Cry1Ia14蛋白（5μg/头）饲喂粉纹夜蛾五龄幼虫,于6hr后围食膜降解,中肠结构变得不完整; Cry1Ia14蛋白饲喂甜菜夜蛾12hr后,围食膜降解,食物与中肠界线不清,中肠结构不完整。根据Mg/EGTA方法,利用差速离心成功分离了甜菜夜蛾和粉纹夜蛾中肠BBMV,CHAPS可以增加BBMV的溶解。经Western blot分析,发现Cry9Ea6和Cry1Ia14的活性多肽均不同程度地结合到了甜菜夜蛾和粉纹夜蛾中肠BBMV上。这些结果为进一步研究Cry蛋白的杀虫机理奠定了基础。
二、苏云金杆菌辅助蛋白基因p19和orf1-orf2对杀虫晶体蛋白Cyt1 Aa表达的影响(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、苏云金杆菌辅助蛋白基因p19和orf1-orf2对杀虫晶体蛋白Cyt1 Aa表达的影响(英文)（论文提纲范文）
（1）Bt杀虫蛋白原核表达及对异迟眼蕈蚊的杀虫活性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 前言 |
| 1.1 食用菌主要害虫 |
| 1.1.1 食用菌害虫害症状 |
| 1.1.2 眼蕈蚊为害特点 |
| 1.2 食用菌眼蕈蚊的防治 |
| 1.2.1 农业防治 |
| 1.2.2 物理防治 |
| 1.2.3 化学防治 |
| 1.2.4 生物防治 |
| 1.3 苏云金芽孢杆菌概况 |
| 1.3.1 苏云金芽孢杆菌的杀虫活性 |
| 1.3.2 苏云金芽孢杆菌的杀虫机理 |
| 1.4 高效杀虫BT工程菌的构建 |
| 1.4.1 种内改造 |
| 1.4.2 种间改造 |
| 1.5 本研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫、菌株和质粒 |
| 2.1.2 供试培养基 |
| 2.1.3 供试化学试剂 |
| 2.1.4 供试试剂盒 |
| 2.1.5 供试仪器 |
| 2.2 菌株筛选 |
| 2.2.1 Bt菌株室内毒力测定 |
| 2.2.2 Bt菌株对食用菌菌丝的影响 |
| 2.3 23 -5 菌株鉴定 |
| 2.3.1 形态鉴定 |
| 2.3.2 生理生化鉴定 |
| 2.3.3 16 S rDNA鉴定 |
| 2.4 23 -5 菌株杀虫蛋白基因型PCR-RFLP鉴定 |
| 2.5 23 -5 菌株杀虫蛋白基因克隆载体构建 |
| 2.5.1 杀虫蛋白引物设计与PCR扩增 |
| 2.5.2 杀虫蛋白基因克隆载体构建 |
| 2.5.3 克隆载体的酶切验证 |
| 2.6 23 -5 菌株杀虫蛋白的生物信息学分析 |
| 2.7 23 -5 菌株杀虫蛋白基因表达载体构建 |
| 2.7.1 载体双酶切及目的片段回收 |
| 2.7.2 目的片段与表达载体连接 |
| 2.7.3 表达载体的双酶切验证 |
| 2.8 23-5 菌株杀虫蛋白表达载体的表达及纯化 |
| 2.8.1 杀虫蛋白表达载体诱导表达 |
| 2.8.2 包涵体蛋白的复变性 |
| 2.8.3 融合蛋白的Ni柱亲和纯化 |
| 2.8.4 Western Blot |
| 2.9 目标蛋白工程菌室内毒力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌株筛选 |
| 3.1.1 室内毒力测定 |
| 3.1.2 菌株对食用菌菌丝的影响 |
| 3.2 23-5 菌株鉴定 |
| 3.2.1 形态鉴定 |
| 3.2.2 生理生化鉴定 |
| 3.2.3 16S rDNA鉴定 |
| 3.3 23-5 菌株杀虫蛋白基因型鉴定 |
| 3.4 23-5 菌株杀虫蛋白基因克隆载体构建 |
| 3.4.1 PCR扩增结果 |
| 3.4.2 杀虫蛋白基因的克隆 |
| 3.5 23-5 菌株杀虫蛋白的生物信息学分析 |
| 3.6 2-5 菌株杀虫蛋白基因表达载体构建 |
| 3.6.1 杀虫蛋白基因表达载体构建 |
| 3.6.2 表达载体的酶切验证 |
| 3.7 23-5 菌株杀虫蛋白表达载体的表达及纯化 |
| 3.7.1 杀虫蛋白表达载体诱导表达 |
| 3.7.2 融合蛋白的Ni柱亲和纯化结果 |
| 3.8 目标蛋白工程菌室内毒力测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 食用菌眼蕈蚊的防治 |
| 4.2 BT菌株杀虫蛋白基因型 |
| 4.3 杀虫蛋白原核表达的特点 |
| 4.4 杀虫蛋白应用研究 |
| 4.5 23-5 菌株的应用前景 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 攻读学位期间取得成果 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（2）苏云金芽胞杆菌cry2类基因表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.1.1 苏云金芽胞杆菌概述 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌的分类 |
| 1.2 Cry蛋白 |
| 1.2.1 Cry蛋白的分类 |
| 1.2.2 Cry蛋白的杀虫活性 |
| 1.2.3 Cry蛋白的作用机制 |
| 1.2.4 Cry2 类蛋白概述 |
| 1.3 Cry蛋白高表达机制 |
| 1.3.1 cry基因所在质粒的拷贝数的影响 |
| 1.3.2 强启动子及STAB-SD序列的影响 |
| 1.3.3 分子伴侣及辅助蛋白的影响 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌的应用 |
| 1.4.1 Bt制剂的应用 |
| 1.4.2 转基因抗虫作物的应用 |
| 1.5 目的意义及研究内容 |
| 1.5.1 目的意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 生化试剂 |
| 2.1.3 培养基与抗生素 |
| 2.1.4 溶液和缓冲液 |
| 2.1.5 供试试虫 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌表达的Cry2 类蛋白的提取 |
| 2.3.2 蛋白样品的SDS-PAGE分析 |
| 2.3.3 模板质粒的序列分析及质粒图谱的绘制 |
| 2.3.4 模板质粒的定点突变 |
| 2.3.5 cry2 类基因在Bt中表达载体的构建 |
| 2.3.6 目的片段的扩增 |
| 2.3.7 目的片段连接、转化 |
| 2.3.8 阳性重组子的鉴定 |
| 2.3.9 Bt感受态细胞的制备与电击转化 |
| 2.3.10 Bt重组菌菌体的形态观察 |
| 2.3.11 Bt菌体蛋白的SDS-PAGE、定量及质谱鉴定 |
| 2.3.12 对几种鳞翅目害虫的生物活性测定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 cry2 类基因在大肠杆菌中表达 |
| 3.1.1 不同温度条件诱导大肠杆菌中cry2 类基因的表达量分析 |
| 3.1.2 Cry2 类蛋白表达量差异位点的分析 |
| 3.1.3 不同温度条件诱导表达的Cry2 类蛋白活性分析比较 |
| 3.2 cry2 类基因在Bt无晶体突变株中表达 |
| 3.2.1 模板质粒的序列分析 |
| 3.2.2 Bt表达载体的构建 |
| 3.2.3 目的片段的连接转化 |
| 3.2.4 阳性重组质粒的鉴定 |
| 3.2.5 Bt重组菌的鉴定 |
| 3.3 Bt中表达的Cry2 类蛋白及其生物活性测定 |
| 3.3.1 重组菌体表达蛋白的SDS-PAGE分析及质谱分析 |
| 3.3.2 Bt重组菌的发酵培养及重组菌体Cry2 类蛋白的定量 |
| 3.3.3 Cry2 类蛋白重组菌对四种鳞翅目害虫的生物活性测定结果 |
| 3.3.4 Cry2 类蛋白重组菌在不同pH缓冲液中的溶解性分析 |
| 3.3.5 中肠液对Cry2 类重组菌的消化情况分析 |
| 3.4 分子伴侣ORF1、ORF2 对表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 大肠杆菌中cry2 类基因表达情况分析 |
| 4.2 苏云金芽胞杆菌中cry2 类基因表达情况分析 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）苏云金芽胞杆菌杀虫晶体形成的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 2 杀虫晶体蛋白 |
| 2.1 杀虫晶体蛋白的分类和命名 |
| 2.2 杀虫晶体蛋白的合成机制 |
| 2.2.1 转录水平调控 |
| 2.2.2 转录后水平调控 |
| 2.2.3 翻译水平调控 |
| 2.3 杀虫晶体蛋白的结构及作用机理 |
| 2.3.1 杀虫晶体蛋白的结构特征 |
| 2.3.2 杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 3 芽胞杆菌同类残食行为的发现与研究现状 |
| 4 杀虫晶体蛋白C-半段的功能研究 |
| 5 辅助蛋白基因的功能研究进展 |
| 6 立题依据和意义 |
| 第二章 Bt4.0718菌株同类残食行为及其功能基因初步分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗生素及其使用终浓度 |
| 1.1.4 分子生物学试剂及生化试剂 |
| 1.1.5 DNA引物合成及测序 |
| 1.1.6 试剂 |
| 1.1.7 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株培养条件 |
| 1.2.2 基因模块的生物信息学分析 |
| 1.2.3 活、死细菌的荧光染色及激光共聚焦显微镜观察 |
| 1.2.4 Bt基因组DNA的提取 |
| 1.2.5 PCR扩增 |
| 1.2.6 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 1.2.7 大肠杆菌的DNA转化 |
| 1.2.8 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 1.2.9 Red/ET同源重组 |
| 1.2.10 pMERⅡ质粒的构建 |
| 1.2.11 XBU001电转 |
| 1.2.12 XBU/pMERⅡ菌落PCR鉴定 |
| 1.2.13 XBU/△spRⅡ::Erm敲除菌株筛选 |
| 1.2.14 pHTsdpRIABC质粒构建 |
| 1.2.15 XBU/pHTsdpRIABC菌株构建 |
| 1.2.16 XBU/pHTsdpRIABC菌株的抑菌活性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bt4.0718菌株同类残食行为基因模块的初步分析 |
| 2.2 Bt4.0718菌株生长曲线测定和显微镜观察 |
| 2.3 Bt4.0718菌株同类残食现象的激光共聚焦显微镜观察 |
| 2.4 XBU/△spRⅡ::Erm敲除菌株的构建 |
| 2.4.1 pMERⅡ质粒的构建 |
| 2.4.2 XBU/pMERⅡ菌落PCR鉴定 |
| 2.4.3 XBU/△sdpRⅡ::Erm缺失突变株的筛选 |
| 2.5 XBU/pHTsdpRIABC表达菌株的构建 |
| 2.5.1 pHTsdpRIABC质粒构建 |
| 2.5.2 XBU/pHTsdpRIABC菌株鉴定 |
| 2.6 XBU/pHTsdpRIABC菌株的抑菌活性分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Cry1Ac原毒素非毒性区域半胱氨酸残基的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗生素及其使用终浓度 |
| 1.1.4 DNA引物合成及测序 |
| 1.1.5 试剂 |
| 1.1.6 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株培养条件 |
| 1.2.2 Bt基因组DNA的提取及PCR扩增 |
| 1.2.3 大肠杆菌质粒DNA的转化及质粒DNA的提取 |
| 1.2.4 pU1Ac19克隆载体的构建 |
| 1.2.5 pHT1Ac35表达载体的构建 |
| 1.2.6 PCR介导靶位点的突变 |
| 1.2.7 突变型pMHT1Ac35表达载体的构建 |
| 1.2.8 pHT1Ac35、pMHT1Ac35在XBU001中的表达 |
| 1.2.9 Bt工程菌株镜检、发酵培养及伴胞晶体的提纯 |
| 1.2.10 Bt工程菌株发酵产物的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.11 Bt工程菌株杀虫晶体蛋白的溶解性分析 |
| 1.2.12 重组蛋白的生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pU1Ac19克隆载体的构建 |
| 2.2 pHT1Ac35表达载体的构建 |
| 2.3 pHT1Ac35表达载体电转化XBU001 |
| 2.4 突变型克隆载体pMU1Ac19的构建及突变碱基的确定 |
| 2.5 突变型表达载体pMHT1Ac35的构建 |
| 2.6 突变型表达载体pMHT1Ac35电转化XBU001 |
| 2.7 表达Cry1Ac的野生及C-端单点突变Bt工程菌株的显微镜观察 |
| 2.8 表达Cry1Ac的野生及C-端单点突变Bt工程菌株的蛋白表达分析 |
| 2.9 表达Cry1Ac的C-端叠加突变Bt工程菌株的显微镜观察 |
| 2.10 表达Cry1Ac的C-端叠加突变Bt工程菌株的蛋白表达分析 |
| 2.11 Bt工程菌株杀虫晶体蛋白的溶解性分析 |
| 2.12 N-端突变型克隆载体突变碱基的确定 |
| 2.13 表达Cry1Ac的N-端单点及叠加突变工程菌株的显微镜观察 |
| 2.14 表达Cry1Ac的N-端单点及叠加突变工程菌株的蛋白表达分析 |
| 2.15 Bt重组工程菌的生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 辅助蛋白对Cry11A表达的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗生素及其使用终浓度 |
| 1.1.4 DNA引物合成及测序 |
| 1.1.5 试剂 |
| 1.1.6 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株的培养条件 |
| 1.2.2 pS11A、pS11A-p20及pS11A-orf2-30C重组质粒的构建 |
| 1.2.3 Bt工程菌株镜检、发酵培养及伴胞晶体提纯 |
| 1.2.4 Bt工程菌株发酵产物的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.5 Bt菌株芽胞晶体蛋白混合物的凝胶包埋 |
| 1.2.6 重组蛋白的胶内酶解 |
| 1.2.7 蛋白酶解肽段的质谱分析及搜库分析 |
| 1.2.8 重组蛋白的生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组质粒及Bt重组工程菌株的构建 |
| 2.2 Bt重组工程菌的相差显微镜观察 |
| 2.3 Bt工程菌重组表达产物的SDS-PAGE分析及质谱鉴定 |
| 2.4 Bt重组工程菌的蚊虫生测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略表(中英文对照) |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文 |
| 课题受资助的基金项目 |
（4）苏云金芽胞杆菌伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白形成相关性的研究（论文提纲范文）
| 缩写表(中英文对照) |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的研究 |
| 1.1 杀虫晶体蛋白(ICPs)的分类 |
| 1.2 杀虫晶体蛋白(ICPs)的结构 |
| 1.3 杀虫晶体蛋白(ICPs)的形成 |
| 1.3.1 转录水平调控机制 |
| 1.3.2 转录后水平调控机制 |
| 1.3.3 翻译后水平调控机制 |
| 2 分子伴侣蛋白概述 |
| 2.1 分子伴侣的定义 |
| 2.2 分子伴侣蛋白的分类 |
| 2.3 分子伴侣蛋白的功能 |
| 2.4 分子伴侣蛋白GroEL、GroES的结构和功能 |
| 2.4.1 GroEL和GroES的结构 |
| 2.4.2 GroEL和GroES的功能 |
| 2.4.3 GroEL和GroES的作用机制 |
| 3 立题依据和意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试菌株、质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 试剂 |
| 1.3.1 试剂盒 |
| 1.3.2 Maker和酶 |
| 1.3.3 基因组提取试剂 |
| 1.3.4 琼脂糖凝胶电泳试剂 |
| 1.3.5 蛋白质凝胶电泳相关试剂 |
| 1.3.6 蛋白Ni+柱亲和纯化试剂 |
| 1.3.7 免疫印迹试剂 |
| 1.3.8 其他试剂 |
| 2 仪器与设备 |
| 3 反应体系 |
| 4 方法 |
| 4.1 苏云金芽胞杆菌基因组提取 |
| 4.2 GroEL、GroES和30s核糖体蛋白的异源表达 |
| 4.2.1 groel、groes和30s ribosomal protein基因片段的获得 |
| 4.2.2 重组质粒(pET28a-GroEL、pET28a-GroES和pET28a-30s)构建 |
| 4.2.3 感受态细胞的制备 |
| 4.2.4 GroEL、GroES和30s核糖体蛋白融合蛋白的表达和纯化 |
| 4.3 GroEL、GroES和30s核糖体蛋白的免疫印迹检测 |
| 4.3.1 制备Anti-GroEL、Anti-GroES和Anti-30s的抗体 |
| 4.3.2 western blotting检测 |
| 4.4 groel基因的敲除 |
| 4.4.1 敲除重组载体的构建 |
| 4.4.2 groel基因的敲除 |
| 4.4.3 相差显微镜观察敲除菌株△groel和原始菌株KCTF12的差异 |
| 4.5 激光共聚焦观察伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白的相互作用 |
| 4.5.1 显微镜观察菌株的培养 |
| 4.5.2 显微镜观察菌体样品的制备 |
| 4.5.3 菌体样品的激光共聚焦显微镜观察 |
| 4.6 生物信息学分析 |
| 结果与分析 |
| 1 groel、groes和30s ribosomal protein基因的异源表达 |
| 1.1 groel、groes和30s ribosomal protein基因片段的获得 |
| 1.2 重组质粒(pET28a-GroEL、pET28a-GroES、pET28a-30s)的构建 |
| 1.3 GroEL、GroES蛋白的异源表达 |
| 2 GroEL、GroES和30s核糖体蛋白的免疫印迹检测 |
| 2.1 GroEL、GroES蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.2 不同生长时期Bt4.0718菌株细胞形态 |
| 2.3 Bt4.0718菌株不同生长时期GroEL、GroES蛋白的免疫印迹 |
| 3 groel基因的敲除 |
| 3.1 敲除重组载体的构建和鉴定 |
| 3.2 相差显微镜观察敲除菌株△groel与原始菌株KCTF12的差异 |
| 4 GroEL、GroES和晶体蛋白的激光共聚焦显微镜观察 |
| 5 GroEL和GroES蛋白的相互作用网络 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 课题受资助的基金项目 |
| 论文发表情况 |
（5）苏云金芽胞杆菌的9个新型杀虫蛋白基因的克隆、表达和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1. 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌及其活性物质 |
| 1.1.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌的活性物质 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白 |
| 1.2.1 杀虫晶体蛋白的分类及多样性 |
| 1.2.2 辅助蛋白与Cry蛋白形成的关系 |
| 1.2.3 杀虫晶体蛋白基因的结构与功能 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌的营养期杀虫蛋白 |
| 1.3.1 营养期杀虫蛋白的分类 |
| 1.3.2 营养期杀虫蛋白的杀虫活性和作用机理 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌的应用现状 |
| 1.5 苏云金芽胞杆菌新基因的发掘策略 |
| 1.5.1 传统的新基因发掘策略 |
| 1.5.2 基于第二代高通量测序和BtToxin_scanner系统建立的发掘策略 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA常规操作 |
| 2.2.2 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体显微镜观察 |
| 2.2.3 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的制备 |
| 2.2.4 晶体蛋白浓度测定方法 |
| 2.2.5 蛋白的SDS-PAGE蛋白质电泳 |
| 2.2.6 以棉铃虫作为供试昆虫的毒力测定 |
| 2.2.7 以孑孓作为供试昆虫的毒力测定 |
| 2.2.8 以秀丽小杆线虫供试害虫的毒力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 新型杀虫蛋白基因的克隆 |
| 3.1.1 确定要克隆的候选基因 |
| 3.1.2 确定基因菌株来源信息 |
| 3.1.3 克隆新型杀虫蛋白基因 |
| 3.2 新型杀虫蛋白基因的生物信息学分析 |
| 3.2.1 杀虫晶体蛋白的生物信息学分析 |
| 3.2.2 营养期杀虫蛋白的生物信息学分析 |
| 3.3 新型杀虫晶体蛋白基因的表达和活性研究 |
| 3.3.1 cry29Ba1和cry21Ea1在苏云金芽胞杆菌中表达 |
| 3.3.2 cry73Aa1在苏云金芽胞杆菌中表达 |
| 3.3.3 杀虫晶体蛋白Cry29Ba1、Cry21Ea1和Cry73Aa1的活性研究 |
| 3.4 实验室已克隆的8个cry基因的表达和活性研究 |
| 3.4.1 已克隆的8个cry基因的表达检测 |
| 3.4.2 部分杀虫晶体蛋白的毒性测定 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）苏云金芽胞杆菌MC28基因组完成图及其杀虫功能基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1 微生物基因组学 |
| 1.1 微生物基因组学的研究进展 |
| 1.2 微生物基因组学的主要内容 |
| 2 腊状芽胞杆菌群细菌基因组研究进展 |
| 3 Bt研究进展 |
| 3.1 Bt的生物学特性 |
| 3.2 杀虫晶体蛋白基因的分类 |
| 3.3 杀虫晶体蛋白的结构和杀虫机理 |
| 3.4 Bt中其它杀虫蛋白的研究 |
| 3.4.1 营养期杀虫蛋白 |
| 3.4.2 苏云金素 |
| 3.4.3 S-layer蛋白 |
| 3.4.4 双效菌素 |
| 3.4.5 肠毒素 |
| 3.4.6 抗癌蛋白 |
| 3.4.7 蛋白酶类杀虫因子 |
| 3.5 Bt内生质粒的特性 |
| 3.6 Bt菌株及其杀虫晶体蛋白的应用 |
| 3.6.1 Bt工程菌的构建 |
| 3.6.2 杀虫晶体蛋白基因在植物抗虫基因工程中的应用 |
| 4 Bt MC28的特性 |
| 5 本课题的立题依据和意义 |
| 第二章 Bt MC28全基因组组装及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 Bt MC28总DNA提取 |
| 1.2.2 Bt MC28基因组测序和组装 |
| 1.2.3 Bt MC28基因组完成图组装 |
| 1.2.4 完成图组装结果检验 |
| 1.2.5 基因组和内生质粒的开放阅读框预测及注释 |
| 1.2.6 Bt MC28基因组共线性分析 |
| 1.2.7 Bt MC28基因组进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bt MC28基因组测序结果 |
| 2.2 Bt MC28基因组基本特性 |
| 2.3 Bt MC28染色体上毒力因子的预测和功能分析 |
| 2.4 Bt MC28基因组共线性分析 |
| 2.5 Bt MC28的系统进化分析 |
| 2.6 Bt MC28内生质粒分析 |
| 2.6.1 质粒pMC429 |
| 2.6.2 质粒pMC319 |
| 2.6.3 质粒pMC189 |
| 2.6.4 质粒pMC183 |
| 2.6.5 质粒pMC95 |
| 2.6.6 质粒pMC54 |
| 2.6.7 质粒pMC8 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Bt MC28中cry68Aa1、cry70Ba1和cyt1Da1基因原核表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 分子生物学操作 |
| 1.2.2 阳性克隆的筛选 |
| 1.2.3 E coli质粒DNA提取 |
| 1.2.4 Bt MC28中杀虫晶体蛋白基因的克隆 |
| 1.2.5 序列分析 |
| 1.2.6 表达载体构建 |
| 1.2.7 基因表达及SDS-PAGE电泳检测 |
| 1.2.8 生物测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 新型杀虫基因全长克隆及序列分析 |
| 2.2 Cry68Aa1、Cry70Ba1和Cyt1Da1蛋白氨基酸组成及序列分析 |
| 2.2.1 Cry68Aa1蛋白氨基酸组成及分析 |
| 2.2.2 Cry70Ba1蛋白氨基酸组成及分析 |
| 2.2.3 Cyt1Da1蛋白氨基酸组成及分析 |
| 2.3 杀虫基因表达载体构建 |
| 2.4 杀虫基因在大肠杆菌中的表达和SDS-PAGE检测 |
| 2.5 表达蛋白的生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 cry69Aa1基因在Bt无晶体突变株HD73~-中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 分子生物学操作 |
| 1.2.2 Bt MC28中杀虫晶体蛋白基因的克隆 |
| 1.2.3 序列分析 |
| 1.2.4 表达载体构建 |
| 1.2.5 Bt电击转化 |
| 1.2.6 基因表达及SDS-PAGE电泳检测 |
| 1.2.7 显微观察 |
| 1.2.8 生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 新型杀虫基因全长克隆 |
| 2.2 Cry69Aa1蛋白氨基酸序列及分析 |
| 2.3 杀虫基因的穿梭表达载体构建 |
| 2.4 重组质粒在Bt无晶体突变株HD73~-中的表达 |
| 2.5 杀虫晶体蛋白的扫描电镜观察 |
| 2.6 Bt转化菌株的生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 cry54Ab1操纵子在Bt无晶体突变株HD73~-中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 分子生物学操作 |
| 1.2.2 Bt MC28中杀虫晶体蛋白基因的克隆 |
| 1.2.3 序列分析 |
| 1.2.4 表达载体构建 |
| 1.2.5 Bt电击转化 |
| 1.2.6 基因表达及SDS-PAGE电泳检测 |
| 1.2.7 显微观察 |
| 1.2.8 生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 新型杀虫基因全长克隆 |
| 2.2 Cry54Ab1和Orf2蛋白氨基酸序列及分析 |
| 2.2.1 Cry54Ab1蛋白氨基酸序列 |
| 2.2.2 Orf2蛋白氨基酸序列 |
| 2.3 杀虫基因的穿梭表达载体构建 |
| 2.4 重组质粒在Bt无晶体突变株HD73~-中的表达 |
| 2.5 杀虫晶体蛋白的扫描电镜观察 |
| 2.6 Bt转化菌株的生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 总结及后期实验展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表科研论文情况 |
| 专利申请情况 |
| 正式命名的新型杀虫晶体蛋白基因 |
（7）苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌及其作为生防微生物研究历史 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白分类及杀虫活性 |
| 1.3 cry 基因的鉴定 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构及功能 |
| 1.4.1 DomainⅠ |
| 1.4.2 DomainⅡ |
| 1.4.3 Domain Ⅲ |
| 1.5 杀虫晶体蛋白的作用机制 |
| 1.5.1 Bravo 模型 |
| 1.5.2 Zhang 模型 |
| 1.5.3 Jurat-Fuentes 模型 |
| 1.6 营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal proteins ,VIPs) |
| 1.6.1 营养期杀虫蛋白分类及杀虫活性 |
| 1.6.2 Vip 蛋白的结构、功能及作用机理 |
| 1.7 苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的应用及局限性 |
| 1.7.1 苏云金芽胞杆菌的应用 |
| 1.7.2 苏云金芽胞杆菌应用的局限性 |
| 1.8 苏云金芽胞杆菌的增效途径 |
| 1.9 蛴螬及其危害现状 |
| 1.10 苏云金芽胞杆菌与蛴螬防治 |
| 1.11 本研究的立题依据、研究内容和目的意义 |
| 1.11.1 立题依据 |
| 1.11.2 研究内容 |
| 1.11.3 目的意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所用菌株和质粒 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 供试昆虫 |
| 2.1.4 所用仪器型号 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 Bt 基因组的提取 |
| 2.2.2 大肠杆菌质粒 DNA 的提取 |
| 2.2.3 获得 HBF-18 基因组 DNA 序列 |
| 2.2.4 获得新杀虫蛋白基因-基因推测 |
| 2.2.5 新基因的序列分析 |
| 2.2.6 RNA 的提取与纯化 |
| 2.2.7 RT-PCR |
| 2.2.8 新基因在大肠杆菌中的克隆 |
| 2.2.9 新基因在大肠杆菌中的表达研究 |
| 2.2.10 新基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中的表达 |
| 2.2.11 Bt 菌株杀虫活性的测定 |
| 2.2.12 生测数据处理与分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 获得新的杀虫蛋白基因序列 |
| 3.2 序列分析 |
| 3.2.1 cry8 -like 基因序列分析 |
| 3.2.2 vip1，vip2 基因序列分析 |
| 3.2.3 Vip1，Vip2 蛋白信号肽预测 |
| 3.2.4 新基因在 HBF-18 菌株中的转录分析 |
| 3.3 新基因在大肠杆菌中的克隆及表达 |
| 3.3.1 新基因的 PCR 扩增 |
| 3.3.2 新基因异源表达载体的构建 |
| 3.3.3 新基因在大肠杆菌中的表达 |
| 3.4 新基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中的表达 |
| 3.4.1 新基因在大肠杆菌中的克隆 |
| 3.4.2 工程菌电镜照片 |
| 3.4.3 Cry 蛋白的提取及检测 |
| 3.4.4 硫酸铵沉淀法提取 Vip1、Vip2 分泌蛋白 |
| 3.5 新基因的序列及分析 |
| 3.6 杀虫活性测定结果 |
| 3.6.1 Cry8 对铜绿丽金龟生物活性初筛结果 |
| 3.6.2 Cry8 对小菜蛾生物活性初筛结果 |
| 3.6.3 不同重组菌株及组合对暗黑鳃金龟生物活性测定结果及分析 |
| 3.7 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）苏云金芽胞杆菌胶原酶基因colB1的克隆表达及其在Bt感染昆虫中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 苏云金芽胞杆菌胶原酶在Bt感染昆虫中的功能研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌及其杀虫活性 |
| 1.1.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌的生物活性成分 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的作用模式 |
| 1.3 蜡状芽胞杆菌群的毒力因子 |
| 1.4 胶原和胶原酶 |
| 1.4.1 胶原的结构与类型 |
| 1.4.2 胶原酶概述 |
| 1.4.3 细菌胶原酶的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.3.1 质粒抽提所用试剂 |
| 2.1.3.2 感受态制备所用试剂 |
| 2.1.3.3 SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂 |
| 2.1.3.4 供试昆虫及生物测定饲料 |
| 2.1.3.5 胶原酶活性测定所用试剂 |
| 2.1.3.6 酶和其它试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 常规DNA操作 |
| 2.2.1.1 苏云金芽胞杆菌质粒的抽提 |
| 2.2.1.2 大肠杆菌质粒的抽提 |
| 2.2.1.3 苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提 |
| 2.2.1.4 质粒DNA的脱盐 |
| 2.2.1.5 DNA的体外重组 |
| 2.2.1.6 大肠杆菌的CaCl_2转化 |
| 2.2.1.7 苏云金芽胞杆菌的电转化 |
| 2.2.1.8 大肠杆菌转化子的筛选 |
| 2.2.1.9 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选 |
| 2.2.1.10 PCR扩增 |
| 2.2.1.11 凝胶试剂盒回收DNA片段 |
| 2.2.1.12 同源重组 |
| 2.2.2 RNA抽提及反转录PCR |
| 2.2.2.1 TRIzol法抽提RNA |
| 2.2.2.2 RT-PCR(Reverse transcript PCR) |
| 2.2.3 苏云金芽胞杆菌colB1基因的超量表达与纯化 |
| 2.2.4 杀虫晶体蛋白Cry1Ac的提纯 |
| 2.2.5 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体显微镜观察 |
| 2.2.6 蛋白的SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.6.1 配制SDS-PAGE凝胶 |
| 2.2.6.2 电泳、染色及脱色 |
| 2.2.6.3 SDS-PAGE电泳的蛋白样品制备 |
| 2.2.7 蛋白的定量 |
| 2.2.8 胶原酶的活性鉴定 |
| 2.2.8.1 明胶水解活性鉴定 |
| 2.2.8.2 胶原酶酶活测定 |
| 2.2.9 生物测定 |
| 2.2.9.1 棉铃虫混合饲料法 |
| 2.2.9.2 棉铃虫表面涂布法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 苏云金芽胞杆菌胶原酶的序列分析 |
| 3.2 colB1基因在大肠杆菌中的表达和纯化 |
| 3.3 ColB1蛋白的活性鉴定 |
| 3.4 ColB1蛋白与Cry1Ac复配对棉铃虫的生物测定 |
| 3.4.1 杀虫晶体蛋白Cry1Ac的提纯和浓度测定 |
| 3.4.2 混合饲料法对棉铃虫的生物测定 |
| 3.4.3 表面涂布法对棉铃虫的生物测定 |
| 3.5 BMB171中ColB1在Bt感染昆虫中的功能研究 |
| 3.5.1 BMB171中colBl基因转录水平和表达水平检测 |
| 3.5.1.1 RT-PCR进行转录水平检测 |
| 3.5.1.2 荧光镜检进行表达水平检测 |
| 3.5.2 colB1插入缺失突变体的构建 |
| 3.5.2.1 插入缺失载体的构建 |
| 3.5.2.2 插入缺失突变体的筛选和验证 |
| 3.5.3 缺失突变体芽胞和Cry1Ac定量混合对棉铃虫的生物测定 |
| 3.5.4 缺失突变体发酵液对棉铃虫的生物测定 |
| 4 总结与讨论 |
| 第二章 苏云金芽胞杆菌表达载体的构建 |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的分类及其多样性 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的表达调控 |
| 1.2.1 转录水平的调控 |
| 1.2.2 转录后水平的调控 |
| 1.2.3 翻译水平的调控 |
| 1.2.4 翻译后水平的调控 |
| 1.3 S-层蛋白的启动子 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 利用cry1Ac基因表达调控元件构建苏云金芽胞杆菌表达载体 |
| 3.1.1 载体pBMB1A的构建 |
| 3.1.2 重组菌株的构建 |
| 3.1.3 重组菌株晶体形成和蛋白表达检测 |
| 3.1.4 重组菌株的生物测定 |
| 3.2 利用ctc2基因启动子构建苏云金芽胞杆菌表达载体 |
| 3.2.1 载体pBMBC2的构建 |
| 3.2.2 重组菌株的构建 |
| 3.2.3 重组菌株晶体形成和蛋白表达检测 |
| 4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）苏云金芽胞杆菌cry8E基因转录调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 芽胞形成 |
| 2 芽胞杆菌中的Sigma 因子 |
| 2.1 Sigma 因子σ~A |
| 2.2 Sigma 因子σ~H |
| 2.3 Sigma 因子σ~E |
| 2.4 Sigma 因子σ~K |
| 3 杀虫晶体蛋白 |
| 3.1 杀虫晶体蛋白基因 |
| 3.2 杀虫晶体蛋白基因的定位 |
| 3.3 杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 3.4 Cry 蛋白的表达调控 |
| 4 对地下害虫具有杀虫活性的cry8 类基因 |
| 5 本研究的立题依据和目的意义 |
| 6 研究思路 |
| 第一章 sigH 基因缺失突变株的构建与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 研究方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 sigH 基因的克隆与序列分析 |
| 2.2 SigH 蛋白的生物信息学分析 |
| 2.3 sigH 基因缺失突变株的构建与鉴定 |
| 2.4 sigH 基因恢复菌株的构建 |
| 2.5 sigH 基因启动子的转录活性分析 |
| 2.6 sigH 缺失突变体的特点分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 sigK 基因插入失活突变株的构建与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 sigK 基因插入失活片段的构建 |
| 2.2 sigK 基因突变质粒的构建与鉴定 |
| 2.3 sigK 基因突变体的筛选与验证 |
| 2.4 sigK 基因突变体遗传恢复菌株的构建与筛选 |
| 2.5 sigK 基因突变体的特点 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 苏云金芽胞杆菌cry8E 基因转录调控机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 cry8E 操纵子Locus 序列分析 |
| 2.2 cry8E 操纵子Locus 的RT-PCR 分析 |
| 2.3 cry8E 操纵子启动子区鉴定 |
| 2.4 orf1 基因启动子转录调控研究 |
| 2.5 cry8E 基因启动子转录调控研究 |
| 2.6 cry8E 操纵子启动子区的转录活性分析 |
| 2.7 cry8 类基因启动子的生物信息学分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 cry8E 操纵子的启动子及其调控类型 |
| 3.2 转录起始位点测定 |
| 4 小结 |
| 第四章 orf1 基因功能的初步研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ORF1 生物信息学分析 |
| 2.2 orf1 缺失对cry8E 启动子区转录活性影响 |
| 2.3 orf1 基因缺失对Cry 蛋白表达的影响 |
| 2.4 orf1 基因反向启动子活性发现 |
| 2.5 orf1 基因互补试验 |
| 2.6 ORF1 细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 苏云金芽胞杆菌cry 基因启动子活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pHTlac 载体构建 |
| 2.2 载体构建 |
| 2.3 cry 基因启动子转录活性比较 |
| 2.4 不同启动子指导的 Cry1Ac 蛋白表达载体构建 |
| 2.5 晶体形态观察 |
| 2.6 不同启动子指导的 Cry1Ac 蛋白产量分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）苏云金芽胞杆菌菌株Bt11和GS8的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.1.1 杀虫毒素 |
| 1.1.2 杀虫蛋白与其它物质间的增效 |
| 1.1.3 杀虫晶体蛋白的应用 |
| 1.2 昆虫抗性的产生，抗性机制与抗性治理策略 |
| 1.3 昆虫中肠围食膜的研究进展 |
| 1.3.1 围食膜蛋白的种类及其特性 |
| 1.3.2 围食膜的形成机理及破坏机制 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第2章 Bt 菌株GS8 和Bt11 生物学特性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 菌株培养性状及形态观察 |
| 2.2.2 培养特征和生理生化反应 |
| 2.2.3 菌株GS8 和Bt11 的生长特性 |
| 2.2.4 菌株的生物活性测定 |
| 2.2.5 杀虫晶体蛋白SDS-PAGE 分析 |
| 2.2.6 质粒分析 |
| 2.2.7 PCR-RFLP 鉴定结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 cry9Ea 基因的克隆表达及相关分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 研究方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 cry9Ea 基因的PCR 扩增 |
| 3.2.2 cry9Ea 基因的克隆 |
| 3.2.3 cry9Ea 基因的序列测定与分析 |
| 3.2.4 Cry9Ea6 氨基酸序列及蛋白质特性分析 |
| 3.2.5 Cry9Ea6 蛋白的表达 |
| 3.2.6 Cry9Ea6 蛋白的可溶性分析及定量分析 |
| 3.2.7 Cry9Ea6 蛋白生物活性测定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 cry1I 基因的克隆表达及相关分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 研究方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 cry1Ia 和 cry1Ib 基因的 PCR 扩增 |
| 4.2.2 cry1Ia 和 cry1Ib 基因的克隆 |
| 4.2.3 cry1Ia 和 cry1Ib 基因的序列测定与分析 |
| 4.2.4 Cry1Ia 和 Cry1Ib 氨基酸序列及蛋白质特性分析 |
| 4.2.5 Cry1Ia14 和 Cry1Ib3 蛋白的表达 |
| 4.2.6 Cry1Ia14 和 Cry1Ib3 蛋白的可溶性分析及定量 |
| 4.2.7 Cry1Ia14 和 Cry1Ib3 蛋白生物活性测定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 工程菌的构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株与载体 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 抗生素 |
| 5.1.4 试剂 |
| 5.1.5 研究方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 穿梭表达载体的构建 |
| 5.2.2 工程菌 HD9EA、HD1IA 和 HD1IB 的构建和验证 |
| 5.2.3 工程菌 HD9EA、HD1IA 和 HD1IB 的 SDS-PAGE 检测 |
| 5.2.4 晶体形态检测 |
| 5.2.5 工程菌 HD9EA、HD1IA 和 HD1IB 的生长特性 |
| 5.2.6 工程菌的遗传稳定性 |
| 5.2.7 晶体蛋白的提取及定量 |
| 5.2.8 工程菌的生物活性测定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 Cry 蛋白抗体的制备 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 研究方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 cry1Ia14 基因的克隆 |
| 6.2.2 重组质粒 p301IA 的构建与目的蛋白的表达 |
| 6.2.3 Cry1Ia14 蛋白的纯化 |
| 6.2.4 Cry9Ea6 晶体蛋白的提取和纯化 |
| 6.2.5 Cry1Ia14 和 Cry9Ea6 蛋白的多克隆抗体制备及检测 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 Bt 毒蛋白杀虫机理的初步研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 供试昆虫及菌株 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.1.3 部分存储液、缓冲液配方蛋白质电泳试剂及缓冲液 |
| 7.1.4 主要仪器设备 |
| 7.1.5 Bt Cry9Ea6 晶体蛋白和 Cry1Ia14 融合蛋白的提取 |
| 7.1.6 蛋白浓度的测定 |
| 7.1.7 甜菜夜蛾、粉纹夜蛾中肠围食膜的提取 |
| 7.1.8 Trypsin 消化Cry 蛋白 |
| 7.1.9 Trypsin 消化后的蛋白生物活性测定 |
| 7.1.10 Trypsin 消化后的蛋白处理甜菜夜蛾围食膜和粉纹夜蛾围食膜 |
| 7.1.11 毒素蛋白对甜菜夜蛾和粉纹夜蛾中肠围食膜的影响 |
| 7.1.12 SDS-PAGE 凝胶硝酸银染色 |
| 7.1.13 石蜡切片的制作 |
| 7.1.14 甜菜夜蛾和粉纹夜蛾中肠BBMV 的提取 |
| 7.1.15 甜菜夜蛾和粉纹夜蛾中肠BBMV 的SDS-PAGE 电泳检测 |
| 7.1.16 甜菜夜蛾和粉纹夜蛾中肠BBMV 的Western 印迹 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 Trypsin 消化Cry 蛋白 |
| 7.2.2 Trypsin 消化Cry 蛋白后生物活性测定结果 |
| 7.2.3 Cry 蛋白处理甜菜夜蛾围食膜和粉纹夜蛾围食膜 |
| 7.2.4 Cry 蛋白对甜菜夜蛾、粉纹夜蛾中肠的影响 |
| 7.2.5 中肠BBMV 的制备及特性研究 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
四、苏云金杆菌辅助蛋白基因p19和orf1-orf2对杀虫晶体蛋白Cyt1 Aa表达的影响(英文)（论文参考文献）
- [1]Bt杀虫蛋白原核表达及对异迟眼蕈蚊的杀虫活性[D]. 王帆帆. 山西农业大学, 2019(07)
- [2]苏云金芽胞杆菌cry2类基因表达研究[D]. 李长慧. 中国农业科学院, 2019(08)
- [3]苏云金芽胞杆菌杀虫晶体形成的分子机制研究[D]. 胡泉芳. 湖南师范大学, 2014
- [4]苏云金芽胞杆菌伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白形成相关性的研究[D]. 刘霜. 湖南师范大学, 2014
- [5]苏云金芽胞杆菌的9个新型杀虫蛋白基因的克隆、表达和功能研究[D]. 尹学琳. 华中农业大学, 2013(02)
- [6]苏云金芽胞杆菌MC28基因组完成图及其杀虫功能基因研究[D]. 关鹏. 四川农业大学, 2013(03)
- [7]苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究[D]. 张彦蕊. 中国农业科学院, 2012(10)
- [8]苏云金芽胞杆菌胶原酶基因colB1的克隆表达及其在Bt感染昆虫中的功能研究[D]. 郑文. 华中农业大学, 2011(08)
- [9]苏云金芽胞杆菌cry8E基因转录调控机制研究[D]. 杜立新. 河北农业大学, 2011(07)
- [10]苏云金芽胞杆菌菌株Bt11和GS8的研究[D]. 刘廷辉. 河北农业大学, 2009(02)