一、人胃癌相关蛋白VRG107基因的扩增及组织表达初步研究（论文文献综述）
李玲[1]（2021）在《基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响》文中指出研究目的:前期研究证实归芪白术方辅助治疗胃癌（Gastric Cancer,GC）有效改善机体不良反应,提高患者的生存质量,但发挥作用的物质基础和分子机制尚不清楚。本研究运用化学信息学-分子对接-分子动力学结合蛋白检测方法及细胞生物学方法,揭示归芪白术方通过健脾扶正促进免疫活性（靶向免疫检查点PD-L1（程序性死亡受体配体1,Programmed cell death ligand 1）调节免疫细胞功能）同时兼备化瘀祛邪抑制肿瘤增殖（靶向HER2（人表皮生长因子受体2,Human epidermal growth factor receptor 2）抑制肿瘤细胞增殖）的药效物质基础,以及探讨该复方“多点显效,协同增效”的功效特点。研究方法:1.结合临床治疗靶向及数据库筛选归芪白术方治疗GC的作用靶点。使用化学信息学方法构建归芪白术方小分子成分结构库,筛选促进肿瘤细胞增殖的HER2和抑制淋巴细胞活性的PD-L1作为研究靶蛋白;确定靶蛋白（HER2/PD-L1）晶体结构及活性位点,应用分子对接技术,筛选能够与靶蛋白有效结合的代表性靶向成分,并进行分子动力学模拟、结合自由能计算和微量热泳动实验（Microscale thermophoresis,MST）,验证其与靶蛋白结合的亲和力,酶活实验检测中药（Traditional Chinese Medicine,TCM）小分子对HER2的作用。2.检测靶向HER2的中药小分子在不同GC细胞株的抗肿瘤效果;使用靶向HER2的中药小分子干预EGF（表皮细胞生长因子,Epidermal growth factor）刺激的胃癌MKN-45细胞,检测其对GC细胞增殖、克隆形成能力以及对PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT））通路相关蛋白及基因表达的影响;使用抑制PD-L1的中药小分子干预可溶性PD-L1刺激的人外周血T淋巴细胞,检测其对T细胞增殖、细胞因子IFN-γ/IL-2（干扰素γ（Interferon-gamma,IFN-γ）/白介素2（Interleukin-2,IL-2））表达量、PD-1+（程序性死亡受体1,Programmed cell death protein 1）T细胞数量及T细胞功能相关蛋白、基因表达的影响。3.构建人胃癌MKN-45细胞和人外周血T淋巴细胞共培养体系;使用抑制PD-L1的中药小分子formononetin,靶向HER2的中药小分子quercetin,以及quercetin和formononetin配伍干预共培养体系,检测中药小分子干预对T细胞增殖、细胞因子（IFN-γ/IL-2）表达量、T细胞凋亡的影响,观察中药小分子对共培养体系中T细胞功能抑制的干预作用;同时检测中药小分子对GC细胞增殖、凋亡的影响,研究其对GC细胞增殖的抑制作用。研究结果:1.筛选得到HER2和PD-L1作为研究归芪白术方治疗GC物质基础及作用机制的有效靶点。2.归芪白术方中有385个中药小分子与HER2蛋白对接得分值≤-4,189个中药小分子与PD-L1蛋白对接得分值≤-4。选择对接得分较高的中药小分子进行MST,黄芪中的daidzein（大豆苷元）、黄芪/甘草中的quercetin（槲皮素）与HER2具有较高结合亲和力,Kd值分别为3.7μM/490 n M;黄芪/甘草中的isorhamnetin（异鼠李素）/formononetin（刺芒柄花素）与PD-L1具有较高结合亲和力,Kd值分别为667 n M/355 n M。50 ns分子动力学模拟结果显示quercetin与HER2结合模式较稳定,结合自由能为-26.55 Kcal/mol,formononetin与PD-L1结合模式较稳定,结合自由能为-19.41 Kcal/mol。酶活性检测结果显示quercetin能够明显抑制HER2激酶活性,IC50为570.7 n M,daidzein对HER2没有明显的抑制作用。3.通过单独干预EGF刺激的胃癌MKN-45细胞和PD-L1刺激的人外周血T淋巴细胞,发现quercetin能够抑制EGF诱导的GC细胞增殖和克隆形成（P<0.05）,同时抑制HER2、PI3K、AKT蛋白及基因的表达（P<0.05）。Quercetin可通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制GC细胞增殖;formononetin能够一定程度降低PD-1在T淋巴细胞的表达,提高细胞上清液中细胞因子（IFN-γ/IL-2）的表达量,提高PI3K、AKT、p-zap70（T细胞受体相关蛋白激酶70,Zeta chain of T cell receptor associated protein kinase 70）等蛋白的表达（P<0.05）,解除PD-L1导致的T淋巴细胞功能抑制,是通过阻断PD-1/PD-L1信号通路及活化下游PI3K/AKT信号通路实现的。4.靶向HER2和PD-L1的中药小分子配伍干预GC细胞与T淋巴细胞共培养体系,结果显示formononetin、quercetin以及formononetin和quercetin配伍干预能够解除T淋巴细胞增殖抑制、减少T淋巴细胞凋亡、提高细胞因子（IFN-γ/IL-2）表达量、降低PD-1在T淋巴细胞的表达（P<0.05）,并抑制GC细胞增殖（P<0.05）、促进GC细胞凋亡、降低靶蛋白（HER2/PD-L1）在GC细胞的表达,且中药小分子配伍干预效果更好,表明中药小分子配伍干预可以提高共培养体系中的T淋巴细胞活性并且抑制胃癌MKN-45细胞增殖。研究结论:1.分子对接结果从大数据角度初步表明归芪白术方的药效物质基础中既具有可以与促进肿瘤细胞增殖靶蛋白HER2结合的小分子成分,也具有与抑制淋巴细胞活性靶蛋白PD-L1结合的小分子成分,通过“多点显效,协同增效”的功效特点,在阻断HER2抑制肿瘤细胞增殖的同时干预PD-L1通路促进免疫细胞活性;2.细胞生物学研究揭示了归芪白术方“多点显效,协同增效”促进免疫活性并抑制肿瘤的物质基础及健脾化瘀法治疗GC的作用机制;3.揭示中药归芪白术方通过健脾化瘀法治疗胃癌的科学内涵,为归芪白术方的有效性提供更具体的化学、生物信息学支撑,为归芪白术方的开发与转化提供依据,同时为中药复方的现代化研究提供方法学参考。
夏红[2]（2020）在《DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制》文中研究指明二烯丙基二硫（diallyl disulfide,DADS）是大蒜中烯丙基硫化物的一种疏水性的有效药用成分,对多种肿瘤有明显的抑制作用,是一种很有开发潜力的抗肿瘤候选药物。人类DJ-1基因,又名RS/PARK7/CAP1,是PARK7基因编码的属于肽酶C56的蛋白质家族的一个成员。参与转录调控、氧化应激反应、线粒体调节、炎症以及糖基化损伤等许多生物学过程,在多种肿瘤中高表达,调控肿瘤进展、临床侵袭性、分化、癌细胞形态和药物敏感性,在癌症中扮演着关键角色。我们前期在鉴定二烯丙基二硫（diallyl disulfide,DADS）诱导白血病HL-60细胞分化的差异蛋白质中,发现DJ-1蛋白明显下调。本研究在DADS抑制人胃癌细胞增殖与迁移侵袭的基础上,进一步探讨DADS下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性,证实DJ-1是DADS抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性的作用靶点之一,为临床胃癌分子靶向治疗提供理论依据。第一部分:DJ-1、PTEN与p-Akt在胃癌中的表达及临床病理意义目的:探讨DJ-1、PTEN与p-Akt在胃癌中的表达及相应的临床病理意义。方法:采用免疫组织化学方法分别检测组织芯片中胃癌组织、癌旁组织以及正常胃粘膜组织中DJ-1、PTEN与p-AKT的表达。结果:DJ-1和p-Akt在胃癌组织中均呈高表达,与正常胃黏膜与癌旁组织相比,差异具有显着性意义（P<0.05）。并且,在癌旁组织表达明显高于正常胃黏膜（P<0.05）。在淋巴结转移组表达明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）。在Ⅰ+Ⅱ期表达明显低于Ⅲ+Ⅳ期（P<0.05）。但在高分化、中分化、低分化胃腺癌中表达无显着性差异（P>0.05）。PTEN在正常胃粘膜组织中表达明显高于癌旁组织与胃癌组织（P<0.05）,在癌旁组织表达显着高于胃癌组织（P<0.05）。在淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组（P<0.05）。在Ⅰ+Ⅱ期表达明显高于Ⅲ+Ⅳ期（P<0.05）。而在高分化、中分化、低分化胃腺癌的表达具有显着差异（P<0.05）。三种蛋白在不同年龄和性别间表达无显着性差异（P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析表明,DJ-1高表达与胃癌患者的5年总体生存率呈负相关（P<0.05）。而PTEN高表达与胃癌患者的5年总体生存率呈正相关（P<0.05）。小结:1.DJ-1与p-Akt蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌发生、淋巴结转移和TNM分期有关。2.PTEN在胃癌组织中的表达与胃癌分化、淋巴结转移和TNM分期有关。3.DJ-1在胃癌组织中的表达与胃癌患者的生存率呈负相关;PTEN在胃癌组织中的表达与胃癌患者的生存率呈正相关。第二部分:DADS下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭目的:探讨DADS对DJ-1高表达人胃癌SGC-7901细胞系增殖、EMT和侵袭的影响。方法:建立DJ-1稳定高表达的SGC-7901细胞系,分别采用CCK-8、划痕实验、侵袭实验、q RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光等分析DADS对DJ-1高表达人胃癌SGC-7901细胞增殖、EMT和侵袭的作用。结果:Western blot检测发现,经DADS 30mg/l处理24h后的各组胃癌细胞,和对照组相比,DJ-1的表达显着降低,其中,以SGC7901细胞差异最明显,以此选定SGC7901为后续试验的研究对象。进一步通过q RT-PCR与Western blot证实成功构建DJ-1稳定高表达的SGC-7901细胞系。CCK8检测发现,处理前,DJ-1高表达组24h、48h、72h与96h的增殖活性分别为0.579±0.082、0.886±0.153、1.138±0.124与1.344±0.194,较Vector组0.436±0.045、0.557±0.059、0.667±0.057与0.715±0.075呈时间依赖性增加（P<0.05）,表明高表达DJ-1可显着提高SGC7901细胞的增殖能力。而用DADS30mg/L处理24h、28h、72h与96h后,DJ-1高表达组的增殖活性分别为0.560±0.031、0.873±0.017、0.910±0.014与0.936±0.019,较DADS处理前显着降低（P<0.05）,表明DADS可部分抑制DJ-1的表达从而抑制SGC 7901细胞的增殖能力。划痕实验表明,DJ-1高表达能增强SGC-7901细胞的迁移能力。而用30 mg/l DADS处理48h后,DJ-1高表达组和空载体组细胞迁移能力均减弱,表明DADS能减弱DJ-1高表达对SGC7901细胞迁移的影响。Transwell侵袭实验发现,未加DADS组,DJ-1高表达组和空载体组穿过Matrigel基质胶的细胞数分别为179.7±6.0,251.3±4.0（P<0.05）,表明DJ-1高表达可明显促进S G C 7 9 01细胞的侵袭,而DADS 30mg/l处理24h后穿过基质胶的细胞数分别为87.3±7.1,130.0±8.5（P<0.05）,与未处理组相比明显减少。表明DADS能拮抗DJ-1高表达对SGC7901细胞侵袭能力的影响。Western blot证实,与空载体组相比,DJ-1高表达组中DJ-1和p-AKT蛋白表达显着增高,而PTEN表达显着降低,AKT表达无明显差异,EMT相关蛋白E-cadherin、TIMP3显着降低,Vimentin、Snail和MMP-9的表达则显着升高,提示DJ-1可通过抑制PTEN表达促进Akt的活化,进而启动EMT进程。而经DADS30mg/l处理24h后,DJ-1高表达组和空载体组的DJ-1表达明显下调,PTEN表达显着升高,p-Akt显着降低,而Akt水平无明显改变,EMT相关蛋白E-cadherin和TIMP3显着升高,Vimentin、Snail和MMP-9表达显着降低。证实DADS下调DJ-1可调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌细胞EMT。进一步的免疫荧光试验发现,与空载体组相比,DJ-1、Vimentin、TIMP3、MMP-9蛋白在DJ-1高表达组的荧光强度显着增强,表明DJ-1高表达促进EMT相关蛋白Vimentin、TIMP3、MMP-9的表达,而PTEN、E-cadherin在DJ-1高表达组的荧光强度显着减弱,表明DJ-1高表达可抑制PTEN、E-cadherin这两种蛋白的表达;而经DADS 30mg/l处理24h后,与未处理组相比较,各组DJ-1、Vimentin、MMP-9、TIMP3蛋白的细胞染色减弱,而PTEN、E-cadherin蛋白染色增加,表明DADS通过抑制DJ-1的表达从而影响PTEN及EMT相关蛋白表达的变化。小结:DADS可通过下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路从而抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭。第三部分DADS下调DJ-1抑制SGC7901细胞对5-Fu的抗药性目的:探讨DADS下调DJ-1对SGC7901细胞增殖、凋亡与5-Fu敏感性的作用。方法:MTT分析与流式细胞术分别检测DADS在5-Fu不同浓度的情况下,对SGC7901细胞增殖与凋亡能力的影响。q RT-PCR、Western blot与免疫荧光分别检测DADS对各组SGC7901细胞中Bcl-2、XIAP、Caspase-3、MDR-1、P-gp表达水平的变化。结果:在不同浓度5-Fu处理24h后,DADS 30mg/l处理后的各组细胞其增殖抑制率分别较处理前明显提高（P<0.05）。但SGC7901/DJ-1细胞增殖抑制程度没有SGC7901与SGC7901/VCR细胞明显。表明DADS可抑制SGC7901与SGC7901/VCR细胞增殖能力和提高对5-Fu的敏感性。流式细胞术检测显示SGC7901/DJ-1细胞凋亡水平分别低于SGC7901与SGC7901/VCR（P<0.05）,SG C7901凋亡率高于SGC7901/VCR（P<0.05）。DADS处理后,各组凋亡水平分别较对照组凋亡水平均明显升高（P<0.05）。q RT-PCR与Western blot显示,SGC7901/DJ-1细胞MDR-1、P-gp、Bcl-2、XIAP较SGC7901及SGC7901/VCR细胞明显提高（P<0.05）,Caspase-3明显抑制（P<0.05）,DADS处理后,SGC7901、SGC7901/VCR和SGC 7901/DJ-1细胞中MDR-1、P-gp、Bc l-2及XIA P明显降低（P<0.05）。Caspase-3明显上调（P<0.05）。免疫荧光显示,在对照组中,SGC7901/DJ-1细胞P-gp、Bcl-2、XIAP的荧光强度较SGC7901及SGC7901/VCR细胞明显增强,而Caspase-3荧光强度则显着减弱;DADS处理后,三组细胞中P-gp、Bcl-2及XIAP蛋白与相对应的未处理组相比细胞染色降低,而Caspase-3染色增强。结果与q RT-PCR、Western Blot结果一致。小结:DADS下调DJ-1可促进SGC7901细胞对5-Fu的敏感性,与抑制P-gp、MDR-1、Bcl-2及XIAP和促进Caspase-3有关。结论:1.DJ-1、PTEN、p-Akt蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌发生、淋巴结转移和TNM分期有关。2.DADS通过下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭。3.DADS下调DJ-1促进SGC7901细胞对5-Fu的敏感性,与抑制P-gp、MDR-1、Bcl-2及XIAP和促进Caspase-3有关。4.DJ-1可能是DADS抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性的作用靶点之一。
李亚[3]（2020）在《新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究》文中认为我国是胃癌大国,中西医结合治疗是我国胃癌综合治疗的独特模式。临床实践证实采用新加良附方（高良姜、香附、穿山龙）联合化疗针对进展期胃癌较单纯化疗具有更高的临床缓解率和更优的生活质量。机制研究发现新加良附方抗胃癌作用与调控凋亡相关基因表达有关,但其上游调控机制尚未明确。基于前期基础,本研究拟从microRNA角度,深入探讨新加良附方及穿山龙主要成分薯蓣皂苷元对miR-34a/SIRT1/p53通路及miR-34a凋亡相关靶基因的调控作用和对凋亡信号通路的激活作用,明确新加良附方及薯蓣皂苷元的作用机制,为新加良附方治疗胃癌提供基础研究依据。目的通过体内外实验明确新加良附方及成分薯蓣皂苷元对人胃癌细胞功能的抑制作用,基于miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路,明确新加良附方及薯蓣皂苷元抗胃癌作用机制。方法1.新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究①新加良附方及薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验:CCK-8实验检测新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞增殖的作用,流式细胞术检测新加良附方及薯蓣皂苷元对胃癌细胞周期及凋亡的调控作用,划痕实验检测新加良附方抑制胃癌细胞迁移作用;②新加良附方、薯蓣皂苷元调控miR-34a作用:qPCR检测正常胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞miR-34a表达,慢病毒感染构建过表达mi R-34a的胃癌HGC-27细胞,CCK-8方法检测过表达miR-34a胃癌HGC-27细胞增殖功能,划痕实验检测过表达mi R-34a胃癌细胞迁移能力,并通过qPCR方法检测新加良附方、薯蓣皂苷元对miR-34a基因水平影响;③新加良附方、薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究:qPCR方法检测过表达miR-34a后HGC-27细胞miR-34a/SIRTl/p53通路及miR-34a靶基因表达水平,qPCR方法检测新加良附方、薯蓣皂苷元对miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a靶基因及Caspase凋亡通路的作用,Western blot检测新加良附方、薯蓣皂苷元对Caspase凋亡通路作用。2.新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究BSP方法检测胃癌细胞miR-34a甲基化水平,并构建HGC-27胃癌细胞荷瘤小鼠模型,设正常对照组、模型组、新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组、5-Aza-CdR组、中剂量联合组及高剂量联合组,药物干预18天,观察裸鼠一般状态;测量移植瘤长短径,计算瘤体积和抑瘤率,观察裸鼠生存期;qPCR方法检测miR-34a表达情况;Western blot方法检测miR-34a/SIRT1/p53相关蛋白表达及Caspase凋亡通路情况。结果1.新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究新加良附方抑制人胃癌细胞功能实验:新加良附方呈浓度及时间依赖性地抑制HGC-27、MGC80-3及AGS细胞增殖;新加良附方提高G1期HGC-27细胞,降低G2期细胞;新加良附方可诱导HGC-27及MGC80-3细胞凋亡,其中诱导HGC-27细胞凋亡作用显着;与对照组比较,新加良附方组除24h 4mg/mL浓度外,其余各组均可抑制胃癌HGC-27细胞迁移功能,作用呈时间及浓度依赖性;新加良附方可显着抑制MGC80-3细胞迁移功能,作用呈时间依赖性,差异有统计学意义;各浓度新加良附方24h及48h均可抑制AGS细胞迁移;薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验:薯蓣皂苷元呈时间及浓度依赖性地抑制胃癌HGC-27、MGC80-3及AGS细胞增殖作用,差异有统计学意义;薯蓣皂苷元干预后胃癌细胞周期无明显改变;薯蓣皂苷元可诱导HGC-27及MGC80-3细胞凋亡,其中诱导HGC-27细胞凋亡作用显着;新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a作用:HGC-27、MGC80-3及AGS细胞中miR-34a相对表达量显着低于正常细胞GES-1,p<0.05;与阴性对照组相比较,过表达miR-34a后,HGC-27细胞增殖能力受到显着抑制,并可显着抑制其迁移能力;新加良附方及薯蓣皂苷元干预后,HGC-27及AGS细胞miR-34a表达水平升高,p<0.01;新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究:过表达miR-34a显着上调p53并下调SIRT1表达水平,可提高Bax及Caspase-3 mRNA表达水平,降低Bcl-2及Survivin的mRNA表达水平;新加良附方及薯蓣皂苷元干预可提高p53表达,降低SIRT1表达水平,并可上调Bax及Caspase-3的mRNA表达水平,降低Bcl-2及Survivin的mRNA表达水平,p<0.01,差异有统计学意义;Z-VAD-FMK可降低新加良附方及薯蓣皂苷元诱导的HGC-27细胞凋亡;新加良附方作用后可降低Caspase-9、Caspase-3前体水平,升高活化Caspase-3的表达水平;2.新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究胃癌细胞HGC-27在miR-34a各位点甲基化水平均较高,选取HGC-27细胞构建胃癌荷瘤小鼠模型,药物干预后观察到新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组及中剂量联合组、高剂量联合组裸鼠状态较好,反应灵敏,活动及饮食、饮水量正常,5-Aza-CdR组裸鼠一般状态较差。5-Aza-CdR组裸鼠体重于实验给药第8天后逐渐下降,第11天其体重低于新加良附方高剂量组,差异有统计学意义,第15天,其体重低于模型组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组及高剂量联合组,p<0.05,第18天,其体重低于其余各组,p<0.05,差异有统计学意义。5-Aza-CdR组抑瘤率为32.08%,与模型组比较,p>0.05,差异无统计学意义,中剂量联合组抑瘤率为35.00%,高剂量联合组抑瘤率为37.18%,与模型组相比较,p<0.05,差异有统计学意义。模型组平均生存时间为46.33±10.50天,新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组、中剂量联合组及高剂量联合组裸鼠均未出现死亡现象,平均生存时间为57.00±0.00天,具有延长荷瘤裸鼠生存时间的趋势,5-Aza-CdR组裸鼠平均生存时间为40.33±7.37天,生存时间较模型组短。除新加良附方中剂量组外,其余各治疗组均可提高胃癌miR-34a表达,以联合组作用最为显着;新加良附方中剂量、高剂量、薯蓣皂苷元及高剂量联合组均可显着增加p53蛋白的表达,且药物干预各组均可显着抑制SIRT1 蛋白的表达,可降低 Bcl-2、Survivin 表达,并提高 Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 及 Caspase-3 底物 Cleaved PARP 蛋白的表达。结论1.miR-34a表达水平异常与胃癌发生密切相关;2.新加良附方可抑制胃癌细胞增殖及迁移、调节细胞周期、诱导凋亡,其成分薯蓣皂苷元可抑制胃癌细胞增殖,并诱导胃癌细胞凋亡,机制可能与调控miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a凋亡相关靶基因及激活Caspase凋亡通路相关;3.新加良附方联合5-Aza-CdR可抑制胃癌裸鼠移植瘤生长,并可改善裸鼠一般状态,有维持体重、延长其生存时间的趋势,机制可能与调控miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a凋亡相关靶蛋白及Caspase凋亡信号通路相关。
杨宏新[4]（2020）在《新癌—卵基因SAS1B在人胃癌和甲状腺癌中表达及生物学意义研究》文中认为SAS1B（sperm acrosomal SLLP1 binding protein,SAS1B）是新发现的基因,其表达产物最先在成熟卵细胞表面发现,后来在女性有关的癌症,如子宫癌、卵巢癌中发现有表达。癌症化学疗法是临床上最常见的治疗方法,但它非特异性杀灭癌细胞的同时,正常细胞也受累。如果化疗药物仅识别癌细胞,对其特异性杀灭,无疑会给癌症患者带来福音,但寻找癌细胞表面特异性抗原的研究一直没有重大突破。SAS1B蛋白若仅表达于癌细胞表面,这势必会为癌症治疗提供强有力的靶标,但目前SAS1B基因的功能不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9基因修饰、基因克隆、流式细胞术、实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫组化染色、蛋白纯化、抗体制备、ELISA等技术对人肿瘤组织、胃癌细胞系、小鼠胚胎及成体组织的SAS1B基因开展多角度、全方位、深层次研究,旨在揭示SAS1B基因的生物学意义,为抗癌药物的研制、肿瘤早期诊断以及生殖医学提供翔实依据。（1）采用基因克隆技术构建pET-22b-SAS1B原核表达质粒,转化BL21（DE3）细胞,并通过AKTA pure 25蛋白纯化仪和Millipore 10kDa超滤技术制备SAS1B重组蛋白。利用目的蛋白制备兔抗人SAS1B多克隆抗体;通过间接ELISA检测抗体效价;通过Western Blot检测抗体与SAS1B重组蛋白的反应性;通过ELISA法检测甲状腺癌和胃癌患者血清中SAS1B蛋白的表达,采用免疫组织化学方法检测胃癌和甲状腺癌组织中SAS1B蛋白表达,并对抗体的灵敏性进行了评估。通过检测制备的兔抗人SAS1B多克隆抗体血清效价为1:25600以上;胃癌和甲状腺癌的癌组织中SAS1B在癌细胞胞浆和胞膜都有表达,癌旁组织中SAS1B不表达或低表达;胃癌和甲状腺癌患者血清中SAS1B蛋白表达量显着高于对照组,甲状腺癌患者的检测效果更为明显（P<0.05）,ROC曲线显示SAS1B抗体在胃癌和甲状腺癌的诊断中有很好的灵敏度。研究结果进一步提示,SAS1B表达产物主要存在于细胞膜和部分胞浆,而且具有分泌蛋白质的特征,SAS1B血清学检查结果无疑为临床胃癌和甲状腺癌早期筛查提供了更为经济更为便捷的检测方法,同时SAS1B在胃癌和甲状腺癌组织中特异表达结果提示SAS1B是一个非常有希望的靶标。（2）采用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 pYSY-Cas9--SAS1B-gRNA1-eGFP和pYSY-Cas9-SAS1B1-gRNA2-Puromycin质粒,采用基因克隆技术构建PcDNA3.1+/C-（K）-SAS1B过表达质粒。通过细胞转染技术对胃癌SGC7901细胞进行研究发现,过表达SAS1B基因后通过上调中心体复制激酶Aurora-A的表达和上调Bard1 β的表达（P<0.05）,使DNA复制过程包括中心体的复制过程加快,促进细胞增殖。敲除SAS1B基因后下调了 Aurora-A和Bard1 β表达（P<0.05）,细胞周期被阻滞于S期,同时诱发胃癌SGC7901细胞死亡。研究结果证实SAS1B基因可作为诊断和治疗胃癌新的特异性靶标,为临床抗肿瘤新药的研发提供关键靶点。（3）本研究首先以小鼠SAS1B基因的三个特征性结构域进行引物设计,检测小鼠胚胎SAS1B基因表达,发现在小鼠胚胎中存在SAS1B基因表达。然后遵照q-PCR引物设计原则重新设计SAS1B扩增引物,发现SAS1B基因随小鼠胚胎发育表达量逐渐升高,小鼠胚胎E11.5和E12.5的表达量比E7.5、E8.5、E9.5高（P<0.05）,在小鼠胚胎发育过程中Bard1基因和Aurora-A激酶表达量也增高（P<0.05）,尤其Bard1上升趋势明显。小鼠成体组织中SAS1B基因呈现限制性表达,小鼠肾脏和睾丸中有SAS1B基因表达,但小鼠肝脏、小肠、脾脏和肺脏等组织中均没有检测到SAS1B基因表达产物。研究结果说明SAS1B基因可能是一个新型的组织特异性基因,与细胞增殖过程密切相关,不仅参与生殖细胞和胚胎发育,而且与肿瘤发生密切相关,但在肾脏表达的原因有待于进一步深入。综上,SAS1B基因是一个新型癌-卵基因,不仅在卵细胞膜上表达,而且在胚胎发育过程中又开始表达,但在大多数成体组织中不表达,然而当肿瘤发生时,SAS1B基因重启表达。胃癌和甲状腺癌患者血清中SAS1B表达特点进一步说明SAS1B蛋白具有分泌特征,可以影响肿瘤微环境。SAS1B基因可通过上调Bard1基因促进中心体扩增激酶Aurora-A表达而加速肿瘤细胞的增殖,敲除SAS1B基因后Bard1基因下调抑制了 Aurora-A表达,细胞周期被阻滞于S期,同时诱发细胞死亡。故SAS1B基因是肿瘤细胞特异性标志物,对胃癌和甲状腺癌的早期诊断和治疗具有十分重要意义,具有非常好的商业开发价值,也是肿瘤药物开发非常好的靶点,同时SAS1B与生殖医学也密切相关。
代行龙[5]（2020）在《环状RNA circFGD4通过miR-532-3p/APC/β-catenin信号通路调控胃癌增殖、迁移及上皮间质转化的机制研究》文中认为背景:胃癌（Gastric cancer,GC）是全球范围内较为常见的恶性肿瘤之一,也是引起中国乃至世界范围内癌症死亡的主要疾病。尽管胃癌的诊断和综合治疗策略显着提高,但多数进展期胃癌病人经治疗后5年总生存率仅约30%。胃癌病人预后不良的因素与快速增殖能力,淋巴/血源性转移和直接侵袭等恶性生物学行为相关,但引起胃癌发生、发展以及复发、转移等恶性生物学行为的分子机制尚不完全清楚。环状RNA作为一类具有环状结构的非编码RNA,近期在多种肿瘤中报道其可以作为肿瘤的诊断标志物和治疗干预靶点。基于此,我们联合课题组胃癌circRNA芯片结果和GEO数据库中胃癌circRNA芯片结果,筛选并发现了显着差异表达的hsacirc0000390（注:来源于chr12:32760890|32764217,由亲本基因FGD4的8,9,10号外显子反向剪切成环构成,大小为345 bp,命名为circFGD4）作为研究对象。本课题拟探究circFGD4在胃癌中的表达、具有的生物学特性、以及参与调控胃癌的潜在机制,期待通过本研究可以为胃癌诊疗提供新思路和新依据。目的:阐明circFGD4在胃癌的生物学功能作用及其可能调控胃癌进展的分子机制。方法:（1）联合课题组circRNA芯片和GEO数据库中胃癌circRNA芯片筛选胃癌中差异表达的circFGD4分子。qRT-PCR检测在人胃癌及癌旁组织中circFGD4和亲本基因FGD4的表达,分析circFGD4表达与胃癌病人临床数据的相关性,分析在人胃癌组织中circFGD4和FGD4表达的相关性。qRT-PCR和FISH检测在人胃癌细胞中circFGD4的表达和定位。（2）体外实验分别构建过表达或沉默circFGD4的胃癌细胞株,CCK-8、EdU、平板克隆、Transwell、划痕、WB和IF检测circFGD4对胃癌细胞增殖、迁移和EMT的影响。体内实验应用过表达circFGD4的胃癌细胞株构建裸鼠皮下成瘤和肺转移模型,qRT-PCR和IHC检测增殖和EMT等指标。生信分析、qRT-PCR、FISH和双荧光素酶检测circFGD4和miR-532-3p的竞争性结合作用。挽救实验同时干扰circFGD4和miR-532-3p分子,CCK-8、平板克隆、Transwell和WB检测circFGD4通过miR-532-3p对胃癌增殖、迁移和EMT的影响。（3）生信分析筛选miR-532-3p下游分子和信号通路,qRT-PCR、WB和双荧光素酶检测在胃癌细胞中miR-532-3p和APC关系。在胃癌细胞中过表达/干扰circFGD4,WB和IF检测APC表达,挽救实验同时干扰circFGD4和miR-532-3p,WB和IF检测APC表达。在胃癌细胞中过表达或干扰circFGD4,检测TOP/FOP变化和β-catenin表达和定位,挽救实验同时干扰circFGD4和miR-532-3p,检测TOP/FOP变化和β-catenin表达和定位。结果:（1）在人胃癌组织中circFGD4相对低表达,低表达circFGD4与胃癌病人肿瘤分化差和淋巴转移有关。在人胃癌细胞中circFGD4相对低表达,主要位于胃癌细胞的胞浆。circFGD4与亲本基因FGD4在胃癌中表达无明显相关性。（2）体外实验显示circFGD4可以抑制胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和诱导EMT的能力。体内实验显示circFGD4抑制裸鼠皮下成瘤和肺转移的能力,伴随增殖和EMT等指标变化。在胃癌中circFGD4和miR-532-3p存在竞争性结合关系,circFGD4通过竞争性结合miR-532-3p进而抑制胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和诱导EMT变化。（3）生信分析显示miR-532-3p预测的靶向分子（包括APC）与细胞迁移和β-catenin信号通路密切相关。在胃癌中circFGD4和miR-532-3p可分别调控APC表达,挽救实验发现circFGD4竞争性结合miR-532-3p调控APC表达。在胃癌中circFGD4可以调控β-catenin通路,挽救实验发现circFGD4竞争性结合miR-532-3p调控β-catenin通路,引起circFGD4抑制胃癌细胞增殖、迁移和诱导EMT的变化。结论:在胃癌中circFGD4竞争性结合miR-532-3p,进而调控APC表达抑制β-catenin信号,从而抑制了胃癌细胞增殖,迁移和诱导EMT变化。
强占荣[6]（2019）在《miR-21/PTEN/Akt通路在姜黄素抗胃癌中的作用以及PD98059的抗胃癌协同效应》文中研究说明研究背景胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤,其防治任务艰巨。天然植物多酚姜黄素,由于安全、有效、廉价及低毒,且具抗炎、抗肿瘤等功效而备受研究者关注。但其抗肿瘤抗胃癌的机制仍不十分明确,值得探究。miR-21在几乎所有实体肿瘤中都存在高表达,已被公认为致癌因子,可作用多种靶位点调控胃癌的发生和发展。姜黄素是否可通过调控miR-21及其靶通路PTEN/P13K/Akt而预防胃癌的发生及进展值得探究。胃癌的化学防治中存在药物耐药、以及化疗毒副作用大、难以耐受等难题,探索新的抗癌治疗方法具有重要临床意义。姜黄素能否与MAPK通路特异性抑制剂PD98059联合发挥抗胃癌协同作用,未见相关研究,本研究中同时加以探讨。目的1.初步探明姜黄素是否具备有效防治胃癌发生和进展的作用。2.探明miR-21/PTEN/PI3K/Akt通路在姜黄素抗胃癌中的作用,并对该通路进行初步验证。3.探明姜黄素是否与PD98059可发挥协同抗胃癌作用,并探讨相关机制。方法1.体外观察姜黄素及其与PD98059或PTEN特异性抑制剂VO-Ohpic trihydrate联合抗胃癌作用。2.qRT-PCR及western blotting观察姜黄素与PD98059联合作用对miR-21表达及miR-21/PTEN/Akt 通路的影响。3.体外验证miR-21与靶基因PTEN表达关系。4.姜黄素干预MNNG诱导胃上皮细胞GES-1恶性转化作用观察。结果1.（1）姜黄素呈浓度及时间依赖形式诱导胃癌MGC-803细胞增殖抑制,同时能诱导胃癌细胞凋亡。（2）PD98059对姜黄素诱导胃癌细胞凋亡存在明显协同作用。（3）姜黄素能够抑制MGC-803细胞迁移,VO-Ohpic trihydrate有助恢复受姜黄素抑制的MGC-803细胞迁移。2.（1）不同浓度姜黄素作用MGC-803细胞后,随作用浓度增加,miR-21水平逐渐下调,二者之间呈现负相关关系;（2）PD98059联合不同浓度姜黄素作用MGC-803细胞与相应浓度姜黄素单作用组比较miR-21表达呈现增加趋势,提示PD98059联合姜黄素对miR-21水平影响可能有其它机制参与。3.（1）姜黄素随作用浓度（0～40μM）增加能抑制p-Akt的表达,诱导PTE N蛋白表达的上调,PTEN表达与p-Akt的表达呈负相关关系。（2）PD98059与姜黄素联合作用能够使MGC-803细胞p-Akt表达较PD98059或姜黄素单作用组明显减少;在联合作用组,PTEN表达较单作用组减少,提示p-Akt表达调控尚有其它的调控机制参与。4.通过体外细胞实验,利用Real-time PCR、Western blot、双荧光素酶试验验证证明了 miR-21能够靶向调控PTEN基因。5.（1）姜黄素能够抑制MNNG诱导GES-1细胞恶性转化。（2）姜黄素对MNNG诱导GES-1细胞染色体等遗传物质损伤可发挥明显保护性作用。结论1.姜黄素可经miR-21/PTEM/Akt通路诱导胃癌MGC-803细胞凋亡并抑制细胞增殖及迁移。2.姜黄素可抑制MNNG诱导的胃粘膜上皮细胞恶性转化。3.姜黄素与PD98059可发挥协同抗胃癌作用,除miR-21/PTEN/Akt通路参与此协同作用外,可能尚有其它机制。
崔高峰[7]（2019）在《去氢骆驼蓬碱调控PI3K/Akt通路和溶酶体Rab7/RILP诱导Sf9细胞自噬》文中研究指明植物源农药被认为是化学农药的重要补充,在有害生物综合治理中可发挥重要作用。去氢骆驼蓬碱（Harmine）属于β-咔啉生物碱,具有多种生物活性,可用于医药和植物保护等领域。Harmine可通过拒食、生长发育调节等方式有效防控多种昆虫,但其杀虫及发育调节机制尚不明确。本文从harmine对果蝇Drosophila melanogaster生长发育抑制作用和对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体Sf9细胞的增殖抑制作用入手,逐步探索harmine诱导昆虫细胞自噬过程中的主要调控通路,主要结果如下:（1）Harmine对果蝇生长发育的抑制作用呈剂量依赖效应,随着harmine浓度增加（0-200 mg/L）,果蝇蛹的质量、长度、化蛹高度、羽化率、雌雄比等都受到显着抑制。200 mg/L harmine处理后果蝇蛹期生长发育信号网络中的Wnt、Notch、TGF-β、Hippo、Hedgehog等通路上基因的表达呈全面抑制状态,并且各个通路在雌雄差异、胁迫应激中的表现不尽相同。其中,PI3K/Akt通路也受到显着抑制,提示harmine可能通过诱导自噬参与果蝇发育抑制。（2）以harmine为代表的5种β-咔啉生物碱均能抑制Sf9细胞的增殖,在0-0.2 m M之间,抑制作用呈现时间和剂量依赖效应。抑制效果从强到弱依次为harmine>harmol>harmaline>harmalol>tryptoline。其中,不饱和的β-咔啉生物碱harmine和harmol具有较强的生物活性,能损害细胞形态,引起细胞空泡化、肿胀等,随剂量和时间的增加,出现凋亡小体等现象。Harmine和harmol具有很强的自噬诱导能力,能够显着增强Sf9细胞自噬荧光染料Monodansylcadaverine（MDC）和溶酶体染料Lyso Tracker Red的荧光强度,促进Atg8等自噬相关基因和蛋白的表达。（3）不同浓度harmine处理Sf9细胞24 h后,从0.05 m M开始,MDC和Lyso Tracker Red染色荧光增强,自噬相关基因和蛋白表达量逐渐增多,0.2 m M处理后细胞开始出现凋亡现象。选取0.05m M为处理剂量,研究harmine诱导Sf9细胞自噬中转录水平和蛋白水平的变化。Harmine处理Sf9细胞后,转录组中2463个基因上调,689个基因下调,蛋白组中36个蛋白上调,77个蛋白下调。这些差异基因主要富集在内质网、胞外基质和代谢通路等方面,参与细胞的跨膜转运、免疫应激、代谢调节、信号转导、自噬等生命过程,提示了harmine对Sf9细胞的作用方式。（4）PI3K/Akt通路作为重要的自噬调控通路,选用3种特异性通路抑制剂,pictilisib、MK-2206 2HCl和rapamycin和两种通路激活剂1,3-dicaffeoylquinic acid和MHY1485,研究harmine诱导Sf9细胞自噬过程中PI3K/Akt通路的作用。结果表明,通路抑制剂能够显着增强harmine诱导的自噬现象,包括细胞形态和荧光染色等。而2种通路激活剂能缓解harmine产生的细胞增殖抑制作用及荧光染色现象。从而证实PI3K/Akt通路确实参与了harmine诱导的细胞自噬。（5）线粒体特异性染料、线粒体膜电位指示剂及ATPase酶活性检测等发现,线粒体在harmine诱导的自噬中作用相对微弱。重点研究了大自噬中变化比较剧烈的溶酶体。Rab7/RILP在自噬体与溶酶体识别与融合中发挥重要作用,生物信息学分析发现,Rab7在昆虫和哺乳动物中非常保守,而RILP则差异较大,提示可能存在不同作用方式。RNAi干扰和过表达实验,证实Rab7和RILP参与了harmine诱导的昆虫细胞自噬。酵母双杂交和GST-pull down实验发现,RILP需要去掉末端的GC-rich区才能与Rab7互作;昆虫中RILP的N端参与两者相互作用;部分氨基酸的点突变可以影响两者的相互作用,昆虫自噬中Rab7-RILP的互作方式与哺乳动物中存在显着差异。本文通过研究新型杀虫活性成分harmine诱导昆虫细胞自噬和抑制果蝇生长发育的潜在机制,为深入研究harmine的作用方式、相关成分的改造和应用提供了一定理论基础,丰富了昆虫生长发育调节机制及昆虫自噬通路转导研究内容。
杨昌永[8]（2019）在《新型c-Met ADC SHR-A1403制备工艺、药效学及药代动力学研究》文中提出近年来研究表明,靶向c-Met的抗体偶联物（antibody-drug conjugate,ADC）在c-Met高表达的恶性肿瘤中表现出比目前已有小分子抑制剂或抗体更强的抗肿瘤疗效及可控的安全性。SHR-A1403是一款新型c-Met ADC药物,由不可剪切的ATPPA连接子将人源化Ig G2亚型的抗c-Met单克隆抗体与一种新型细胞毒微管抑制剂偶联而成。本论文对SHR-A1403的制备工艺、体内外药效学及药代动力学性质进行了深入的研究和阐述。作为SHR-A1403的组成部分,我们合成了抗c-Met单抗SHR-A1403裸抗和偶联毒素SHR153024。SHR-A1403裸抗采用DNA重组技术在CHO细胞中表达,随后用亲和层析和离子交换法进行纯化,病毒失活和去除后即得终产品。SHR153024在逆合成分析后进一步对合成路线进行了优化以获得适用于工业化生产的工艺,采用液相制备对粗品进行精制,并通过质谱、红外、紫外、核磁等方法对其进行了结构确证。SHR-A1403通过三步偶联法合成,与辅料混合至终浓度10±0.4 g/L。此部分药学研究结果表明SHRA1403及其各组分的制备工艺稳定且可控,获得的产品符合临床前及临床研究用药的标准。在药效学研究中,发现SHR-A1403与人和猴来源的c-Met具有高亲和力,而与小鼠来源的c-Met几乎无亲和力。SHR-A1403在多种肿瘤细胞系中具有较强的抑制细胞增殖活性,且活性基本与细胞表面c-Met蛋白的表达量成正相关。在3种移植有人肿瘤细胞系（肝癌HCCLM3、胃癌MKN-45和肺癌NCI-H1993）及一种移植有来源于肝细胞癌患者肿瘤组织的模型中,SHR-A1403均表现出极强的抗肿瘤效果。经验证,这些模型均高表达c-Met蛋白。随后,在体外实验系统中对SHR-A1403的抗肿瘤作用机制进行了研究,结果显示SHR-A1403裸抗与细胞表面的c-Met结合后促进复合物的内吞,随后转运至溶酶体经蛋白酶水解而释放出偶联的毒素,释放的毒素通过抑制细胞中微管蛋白聚集而阻滞细胞周期,最终发挥细胞杀伤作用。以上研究证实了SHR-A1403在体外、体内均具有良好的抗肿瘤效果,且作用机制也得到了较为清晰的阐述,这些结果为SHRA1403在临床上作为治疗c-Met高表达的癌症提供了有效性依据。SHR-A1403的体内药代动力学研究在正常食蟹猴中开展。给药后,收集的血清均采用ELISA的方法检测ADC和总抗的浓度以及抗药抗体浓度,游离毒素采用LC-MS/MS法检测。研究结果显示,在猴中ADC和总抗的血药浓度均随时间推移而缓慢降低,提示机体对两者的清除均较低,ADC的半衰期长达47.5天。血浆中几乎无法检测到游离毒素,提示了SHR-A1403因毒素在系统中暴露而引起毒性的可能性较低。食蟹猴中抗药抗体的发生率相对较低,且对ADC的药代参数无影响。在早期发现阶段,药物抗体比（DAR）值高（DAR=56）或DAR值低（DAR=1）的SHR-A1403在血清中的暴露量和抗药抗体的发生率不理想,因此最终选择DAR=2的SHR-A1403用于本研究中涉及的所有实验。综上所述,本研究对SHR-A1403的制备工艺进行了探索并最终确定了适用于工业化生产的工艺路线,在体外和体内药效学模型中充分证明了其具有优异的抗肿瘤活性,且在食蟹猴中揭示了其良好的药代动力学性质。这些工作为后续临床前和临床用药的制备提供了技术支持,也为临床试验设计提供了依据。
丁亚杰[9]（2019）在《基于网络药理学和蛋白质组学探究健脾复方胃肠安及活性化合物木犀草素的抗胃癌作用机制》文中指出以健脾为主的中药复方胃肠安（WCA）是上海市名中医、龙华医院肿瘤科邱佳信教授的临床验方,在改善胃癌患者脾虚证、延长生存期、降低根治术后复发转移、减轻化疗不良反应等方面具有确切的临床疗效。实验研究表明基于胃癌“脾虚”病机的复方胃肠安具有明确的抗致突变作用,能在胃癌的起始和启动阶段起到阻断作用;抑制人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的生长和原位移植瘤的转移;抑制胃癌细胞的增殖;诱导胃癌细胞的凋亡;抑制胃癌细胞的侵袭和转移及上皮间质转化;调节免疫等作用。目的:从中药复方研究的整体角度出发,采用网络药理学方法研究复方胃肠安的核心化学成分,作用靶点及信号通路;蛋白质组学技术分析复方胃肠安作用人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型后差异蛋白的变化;采用网络药理学与蛋白质组学联合分析,筛选网络中复方胃肠安共同作用的潜在靶点及信号通路;同时研究复方胃肠安中重要活性化合物木犀草素抗胃癌的潜在作用机制。方法:1.运用网络药理学研究方法,构建化合物-靶标、靶标-疾病及靶标-通路等多水平多层次的网络,利用Cytoscape软件,构建HIPPIE（Human Interated ProteinProtein Interaction r Eference,HIPPIE）蛋白交互网络,对复方胃肠安采用基因本体（Gene Ontology,GO）,KEGG信号通路（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）,疾病本体（Disease Ontology,DO）,医学主题词（Medical Subject Headings,Me SH）的富集分析。根据网络药理学方法获得的活性化合物,核心靶标构建复方胃肠安的靶标网络,采用Cytoscape3.6.0软件计算网络拓扑参数,介数中心性（Betweenness Centrality,BC）,中心接近度（Closeness Centrality,CC）,拓扑系数（Topological Coefficient,TC）,节点度（Degree,DE）,筛选复方胃肠安网络药理学中的核心靶点。2.构建人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型,采用蛋白质组学技术探究复方胃肠安作用人胃癌裸小鼠皮下移植瘤后,与生理盐水对照组比,鉴定差异的上调及下调蛋白,并对差异蛋白进行基因本体GO分析,信号通路KEGG的富集分析。根据蛋白质组学筛选的差异蛋白,将蛋白质组学中的差异上下调蛋白检索公共数据库,构建蛋白质相互作用（PPI）网络,采用Cytoscape3.6.0软件的Cluster One算法对PPI网络进行核心蛋白聚类分析,按照P<0.0001、Node>6、ND（network density）>0.05筛选标准,筛选复方胃肠安蛋白质组学网络中的核心蛋白。3.对复方胃肠安作用后的网络药理学网络和蛋白质组学网络进行联合分析,构建两者共同作用网络,找到网络药理学与蛋白质组学共同重合的靶点。构建人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型,Q-PCR和Western-blot的方法,验证上述的潜在靶点的表达水平。4.采用CCK8（Cell Counting Kit-8）、流式细胞术、Hoechst染色、Western-Blot等技术探究复方胃肠安中重要活性成分木犀草素对胃癌细胞的增殖及凋亡的影响。结果:1.网络药理学分析得到复方胃肠安的136个活性化合物,306个核心靶标,151个胃癌相关靶标。通过生物信息学基因本体GO分析,结果在分子功能（Molecular Function,MF）水平与复方胃肠安显着关联的GO术语有117个,与胃癌有显着关联的GO术语有72个。在生物过程（Biological Process,BP）水平与复方胃肠安显着相关的GO术语有1578个,与胃癌有显着关联的GO术语有1104个。在细胞组件（Cellular Component,CC）水平,与复方胃肠安有显着关联的GO术语有71个,与胃癌有显着相关的GO术语有54个。通过KEGG信号通路富集分析,复方胃肠安靶标与胃癌共关联的信号通路共有8条,包括HIF-1 signaling pathway、Endocrine resistance、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、ERBB signaling pathway、FOXO signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、Thyroid hormone signaling pathway、RAP1 signaling pathway。采用网络分析,在网络药理学的网络中筛选出8个潜在的作用靶点,分别为PTGS2、Bax、Cycs、RELA、ABCC1、HIF1A、TOP1、GSTP1。2.通过蛋白质学技术分析复方胃肠安作用于人胃癌裸小鼠皮下移植瘤后,与生理盐水模型组相比,共鉴定出3385个差异蛋白,其中有2856个蛋白具有定量信息。其中417个蛋白表达上调,大于1.2倍,340个蛋白表达下调,小于0.83倍。通过生物信息学基因本体GO分析,结果显示在分子功能（MF）水平,与复方胃肠安显着相关的GO术语有542个。在生物过程（BP）水平与胃肠安显着相关的GO术语有1940个。在细胞组件（CC）水平与胃肠安显着相关的GO术语有1251个。通过KEGG信号通路富集分析,结果显示,与复方胃肠安的显着相关的信号通路共45条,涉及多条肿瘤相关通路。在构建的蛋白质网络中,共筛选出20个核心蛋白聚类（cluster）。3.对网络药理学的核心靶标,活性化合物,与蛋白质组学筛选的差异蛋白进行联合分析,显示复方胃肠安在网络药理学与蛋白质学共同富集在8条信号通路,分别是TNF Signaling Pathway、IL-17 Signaling Pathway、PI3K-Akt Signaling Pathway、Renin-angiotensin system、Focal adhesion、TNF Signaling Pathway、NF-kappaa B Signaling Pathway、Glycolysis/Glucone Genesis。对复方胃肠安的网络药理学和蛋白质组学网络进行联合分析,网络药理学网络中的8个核心靶标和蛋白质组学网络中20个核心蛋白聚类（cluster）的重叠分析中,ABCC1、PTGS2、Cycs、Bax四个蛋白为两者共同重叠的蛋白。Q-PCR和Western Blot验证结果表明,与对照组相比,复方胃肠安在人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型中,能下调ABCC1和PTGS2蛋白的表达,上调Bax和Cycs蛋白的表达。4.通过实验验证,复方胃肠安重要活性化合物木犀草素干预胃癌细胞后,呈时间-剂量依赖性抑制胃癌细胞增殖,同时将细胞周期阻滞在S期,诱导胃癌细胞凋亡的发生,降低线粒体膜电位,增加Bax,Caspase3,Cycs的表达,降低Bcl-2的表达,下调p-Akt的表达;木犀草素组加入PI3K-Akt通路抑制剂LY294002后,与木犀草素组相比,Bax、Caspase3、Cycs蛋白的表达增加,Bcl-2蛋白表达降低,p-Akt蛋白的表达降低。结论:1.复方胃肠安通过多靶点、多途径发挥抗胃癌作用。其作用机制可能涉及8条信号通路和ABCC1、PTGS2、Cycs、Bax4个核心靶标。2.复方胃肠安抗胃癌机制涉及上调Cycs、Bax的表达,下调ABCC1、PTGS2的表达。3.复方胃肠安中重要活性化合物木犀草素可抑制胃癌细胞增殖,阻滞细胞周期在S期;诱导胃癌细胞凋亡,其诱导凋亡机制与上调Bax的蛋白表达,下调Bcl-2的蛋白表达有关,并可能涉及PI3K-Akt信号通路。
黄姗姗[10]（2019）在《YAP1-AGK正反馈环路促进胃癌细胞进展的分子机制》文中研究说明背景:酰基甘油激酶AGK位于人类染色体7q34区域,是一个多功能的脂质激酶,通过催化酰基甘油磷酸化产生溶血磷脂酸（LPA）,从而参与到人体众多生物学过程中。最近多项证据表明,AGK表达失调与各种人类癌症的发生、发展有关。本课题研究了AGK对胃癌细胞增殖和癌变的影响,并深入研究了其中的分子作用机制。方法:采用免疫组织化学和蛋白质印迹分析检测了胃癌细胞系和胃癌组织中的AGK表达情况;基于免疫组化的结果分析了AGK表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系。通过检测上皮-间充质转变标志物以及CCK-8,集落形成,transwell侵袭和迁移实验以及异种移植模型明确AGK在胃癌中的生物学功能。之后,在胃癌细胞和组织中分析AGK和YAP1之间的相关性,并通过荧光素酶报告基因实验,染色质免疫共沉淀,免疫荧光和qRT-PCR等实验进一步研究两者之间的相互作用机制。结果:免疫组化和western blot实验均显示AGK的表达在胃癌细胞系和组织样品中上调,高表达AGK蛋白与胃癌患者组织分化不佳（P=0.009）并且与胃癌患者预后不良密切相关。过表达AGK能促进胃癌细胞的增殖、侵袭能力和上皮-间充质转变标志物的表达。相反,敲减AGK的表达则抑制胃癌细胞的增殖、侵袭以及裸鼠异种移植模型中的肿瘤形成能力。进一步研究其内在分子机制,我们发现AGK的表达与胃癌细胞和组织中的YAP1的表达呈正相关。转录共激活因子YAP1可通过TEAD与AGK基因启动子区域结合从而转录诱导AGK的表达。此外,AGK通过抑制Hippo信号通路激活进而诱导YAP1核定位增多并增强YAP1/TEAD的转录活性。结论:本研究表明AGK不仅是Hippo-YAP1通路的新靶点,而且它还通过抑制Hippo通路激活从而促进YAP1/TEAD转录活性,形成YAP1-AGK正反馈环路。此外,YAP1-AGK正反馈环路与胃癌的发生、发展密切相关。因此,本研究提示双重靶向AGK和YAP1可能成为未来胃癌治疗的新策略。
二、人胃癌相关蛋白VRG107基因的扩增及组织表达初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人胃癌相关蛋白VRG107基因的扩增及组织表达初步研究（论文提纲范文）
（1）基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 缩略词表 |
| 第一章:基于分子对接虚拟筛选归芪白术方中可与胃癌治疗靶点结合的小分子成分 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验软件和数据库 |
| 1.1.2 主要试剂、仪器 |
| 1.1.3 胃癌靶向治疗靶点筛选 |
| 1.1.4 归芪白术方中药小分子结构库构建及类药性分析 |
| 1.1.5 靶蛋白活性位点 |
| 1.1.6 分子对接 |
| 1.1.7 微量热泳动实验测定虚拟筛选获得成分与靶蛋白的亲和力 |
| 1.1.8 分子动力学模拟和结合自由能计算 |
| 1.1.9 靶向成分的毒性预测 |
| 1.1.10 靶向HER2的小分子成分对HER2激酶活性的检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 胃癌治疗靶点筛选 |
| 1.2.2 归芪白术方小分子成分类药性分析 |
| 1.2.3 靶蛋白晶体结构确定 |
| 1.2.4 分子对接 |
| 1.2.5 MST测定虚拟筛选获得小分子成分与靶蛋白的亲和力 |
| 1.2.6 分子动力学模拟和结合自由能计算结果 |
| 1.2.7 代表性成分quercetin、daidzein、formononetin和 isorhamnetin毒性预测 |
| 1.2.8 Quercetin和daidzein对HER2激酶活性影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 HER2与PD-L1在胃癌表达的相关性分析 |
| 1.3.2 归芪白术方治疗胃癌的物质基础分析 |
| 1.3.3 分子对接-MST-分子动力学模拟-HER2激酶活性检测结果分析 |
| 1.4 小结 |
| 第二章:归芪白术方代表性中药小分子成分对胃癌细胞和T淋巴细胞的作用及机制 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 试剂与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein抗胃癌细胞增殖实验 |
| 2.2.2 胃癌细胞株的选择 |
| 2.2.3 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对胃癌细胞的干预作用 |
| 2.2.4 人外周血T淋巴细胞的分离与活化 |
| 2.2.5 抑制PD-L1的代表性成分formononetin和isorhamnetin对PD-L1干预T细胞的作用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对不同胃癌细胞的抗增殖作用 |
| 2.3.2 胃癌细胞株的选择 |
| 2.3.3 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对胃癌MKN-45细胞干预作用 |
| 2.3.4 T淋巴细胞的分离与活化 |
| 2.3.5 PD-L1刺激T淋巴细胞及干预实验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 靶向HER2的代表性成分quercettin、daidzein抑制胃癌细胞增殖结果分析 |
| 2.4.2 代表性成分Formononetin、isorhamnetin对T淋巴细胞活性的恢复作用 |
| 2.4.3 健脾扶正、化瘀祛邪治疗胃癌的中医认识 |
| 2.5 小结 |
| 第三章:归芪白术方体外有效的代表性中药小分子对胃癌细胞和T淋巴细胞共培养体系的调节作用 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胃癌MKN-45和T淋巴细胞共培养体系构建 |
| 3.2.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预T淋巴细胞与胃癌MKN-45 细胞共培养体系 |
| 3.2.3 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后细胞形态学观察和T淋巴细胞、胃癌MKN-45 细胞增殖情况 |
| 3.2.4 流式细胞术检测体外有效的代表性成分quercetin和 formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞和胃癌MKN-45 细胞凋亡情况 |
| 3.2.5 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞PD-1 表达情况 |
| 3.2.6 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后细胞上清液中细胞因子表达情况 |
| 3.2.7 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞和胃癌MKN-45 细胞相关蛋白表达情况 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌MKN-45细胞与T淋巴细胞共培养体系的建立 |
| 3.3.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 胃癌MKN-45 细胞与T淋巴细胞共培养体系构建结果分析 |
| 3.4.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系结果分析 |
| 3.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 论文综述 HER2、PD-L1生物学特性及在胃癌的相关性和应用研究 |
| 参考文献 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略语索引 |
| 第一部分 DJ-1、PTEN、p-Akt在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病例资料 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 免疫组化染色 |
| 2.2.2 结果判定 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DJ-1 蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.1.1 DJ-1 蛋白在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.1.2 DJ-1 表达与胃癌临床病理指标的关系 |
| 3.1.3 DJ-1 表达与胃癌预后的关系 |
| 3.2 PTEN蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.2.1 PTEN在在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.2.2 PTEN表达与临床胃癌病理指标的关系 |
| 3.2.3 PTEN表达与胃癌预后的关系 |
| 3.3 p-Akt蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.3.1 p-Akt在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.3.2 p-Akt表达与胃癌临床病理指标的关系 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DADS下调DJ-1 负调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌SGC-7901 细胞EMT与侵袭 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验质粒、载体、细胞株、菌株及慢病毒系统 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 关键试剂的配置 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 DJ-1 过表达慢病毒载体构建及病毒包装 |
| 2.2.3 慢病毒转染SGC-7901 细胞以及稳定转染细胞株的筛选 |
| 2.2.4 q RT-PCR(荧光定量PCR) |
| 2.2.5 Western blot检测 |
| 2.2.6 CCK8 增殖实验 |
| 2.2.7 划痕愈合实验 |
| 2.2.8 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.9 细胞免疫荧光 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DADS对各胃癌细胞系DJ-1 表达的影响 |
| 3.2 慢病毒载体构建及病毒包装 |
| 3.3 DJ-1 高表达稳定细胞系的构建 |
| 3.4 qPCR检测DADS处理和转染细胞DJ-1 的表达水平 |
| 3.5 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞增殖能力的影响 |
| 3.6 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞迁移能力的影响 |
| 3.7 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞侵袭能力的影响 |
| 3.8 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞DJ-1/PTEN/AKt信号通路的影响 |
| 3.8.1 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞PTENm RNA表达的影响 |
| 3.8.2 DADS 与DJ-1高表达对SGC7901细胞PTEN/AKt信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.9 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌SGC7901 细胞EMT相关分子的影响 |
| 3.9.1 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞EMT相关分子m RNA的影响 |
| 3.9.2 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞EMT相关分子蛋白表达的影响 |
| 3.10 细胞免疫荧光检测DJ-1、PTEN及 EMT相关蛋白的定位与表达 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 DADS下调DJ-1 抑制人胃癌SGC7901 细胞对5-Fu的抗药性 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 常用试剂的配置 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 qRT‐PCR(荧光定量 PCR) |
| 2.2.3 Western Blot检测 |
| 2.2.4 MTT法检测细胞增殖能力 |
| 2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 细胞免疫荧光实验 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DADS与 DJ-1 高表达对各种SGC7901 细胞增殖的影响 |
| 3.2 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞SGC7901 凋亡的影响 |
| 3.3 DADS与 DJ-1 高表达对各组细胞凋亡相关分子表达的影响 |
| 3.3.1 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 Bcl‐2 表达的影响 |
| 3.3.2 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 XIAP 表达的影响 |
| 3.3.3 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 Caspase‐3 表达的影响 |
| 3.4 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞抗药性的影响 |
| 3.5 免疫荧光检测P-gp、Bcl-2、XIAP及 Caspase-3 定位与表达 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 全部结论 |
| 综述 Role of DJ-1 in cancer: Recent advance |
| References |
| 攻读博士期间的主要科研成果 |
| 致谢 |
（3）新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中药抗胃癌基础研究现状与进展 |
| 1 中药有效成分基础研究 |
| 2 单味中药基础研究 |
| 3 复方基础研究 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 胃癌相关miRNA研究现状与展望 |
| 1 miRNA在胃癌发生发展中的作用研究 |
| 2 miRNA在胃癌诊断治疗中的作用研究 |
| 3 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究 |
| (一) 新加良附方抑制人胃癌细胞功能实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (二) 薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (三) 新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (四) 新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（4）新癌—卵基因SAS1B在人胃癌和甲状腺癌中表达及生物学意义研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 SAS1B基因 |
| 1.3 Aurora基因 |
| 1.4 Bard1基因 |
| 1.5 肿瘤-一个发育生物学问题 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 SAS1B基因原核表达载体构建和重组蛋白制备 |
| 2.1 主要试剂及来源 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 溶液的配制 |
| 2.4 SAS1B原核表达载体的设计 |
| 2.5 重组原核表达质粒pET-22b-SAS1B-His的构建 |
| 2.6 转化 |
| 2.7 阳性克隆的筛选 |
| 2.8 SAS1B表达质粒的制备与鉴定 |
| 2.8.1 pET-22b蛋白表达菌和质粒的制备 |
| 2.8.2 阳性克隆提取质粒进行电泳和测序 |
| 2.9 SAS1B重组蛋白的制备 |
| 2.10 考马斯亮蓝染色和Western blot鉴定纯化蛋白 |
| 2.11 蛋白浓度测定 |
| 2.12 实验结果 |
| 2.12.1 PET-22b-SAS1B质粒电泳结果 |
| 2.12.2 测序结果分析 |
| 2.12.3 蛋白的纯化(亲和层析) |
| 2.12.4 SAS1B重组蛋白的鉴定 |
| 2.13 讨论 |
| 2.14 小结 |
| 3 兔抗人SAS1B多克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 抗原准备 |
| 3.3 制备抗体流程 |
| 3.3.1 采集阴性对照血清 |
| 3.3.2 免疫兔子 |
| 3.3.3 间接ELISA抗体效价检测 |
| 3.4 Western blot检测抗体的反应性 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 抗体效价 |
| 3.5.2 抗体与SAS1B重组蛋白反应性 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 小结 |
| 4 新制备SAS1B抗体检测癌症患者血清SAS1B表达 |
| 4.1 一般资料 |
| 4.2 实验步骤 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 肿瘤患者SAS1B间接ELISA检测结果 |
| 4.3.2 SAS1B抗体的敏感度分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 新制备抗体检测癌组织SAS1B蛋白表达 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 主要设备和主要试剂 |
| 5.3 主要溶液配制 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 组织切片制作 |
| 5.4.2 苏木精-伊红染色 |
| 5.4.3 免疫组织化学染色 |
| 5.4.4 Western blot检测 |
| 5.5 统计学分析 |
| 5.6 实验结果 |
| 5.6.1 HE染色结果 |
| 5.6.2 免疫组化结果 |
| 5.6.3 胃癌免疫组化结果 |
| 5.6.4 胃癌和甲状腺癌组织Western Blot结果 |
| 5.7 讨论 |
| 5.8 小结 |
| 6 SAS1B mRNA在人胃癌和甲状腺癌组织中表达研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 主要试剂 |
| 6.3 实验仪器和设备 |
| 6.4 实验方法 |
| 6.4.1 组织总RNA提取 |
| 6.4.2 逆转录 |
| 6.4.3 普通PCR检测SAS1B基因表达 |
| 6.4.4 q-PCR检测SAS1B基因表达 |
| 6.5 实验结果 |
| 6.5.1 SAS1B普通PCR扩增结果 |
| 6.5.2 SAS1B实时荧光定量PCR结果 |
| 6.5.3 Bard1和Aurora-A实时荧光定量PCR结果 |
| 6.6 讨论 |
| 6.7 小结 |
| 7 基因敲除和过表达SAS1B对胃癌细胞的影响 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.2 主要试剂及来源 |
| 7.3 主要仪器 |
| 7.4 实验方法 |
| 7.4.1 人SAS1B基因敲除质粒的构建 |
| 7.4.2 SAS1B基因过表达质粒制备 |
| 7.4.3 细胞培养 |
| 7.4.4 细胞转染 |
| 7.4.5 敲除和过表达SAS1B细胞的筛选 |
| 7.4.6 细胞总RNA的制备 |
| 7.4.7 RNA浓度的测定 |
| 7.4.8 逆转录 |
| 7.4.9 实时荧光定量PCR |
| 7.4.10 免疫荧光染色 |
| 7.4.11 CCK-8法检测细胞增殖活性 |
| 7.4.12 流式细胞检测对细胞周期的影响 |
| 7.5 溶液配制 |
| 7.6 统计分析 |
| 7.7 结果 |
| 7.7.1 人SAS1B基因敲除质粒转化子PCR验证 |
| 7.7.2 人SAS1B转化子的测序结果 |
| 7.7.3 SAS1B敲除和过表达质粒的电泳结果 |
| 7.7.4 SAS1B敲除和过表达质粒测序比对结果 |
| 7.7.5 细胞培养及转染实验后荧光观察 |
| 7.7.6 Bard1、Aurora-A、SAS1B mRNA表达结果 |
| 7.7.7 Bard1、Aurora-A免疫荧光染色结果 |
| 7.7.8 细胞生长活性检测 |
| 7.7.9 细胞周期检测结果 |
| 7.8 讨论 |
| 7.9 小结 |
| 8 C57 BL/6小鼠胚胎SAS1B基因的表达 |
| 8.1 实验材料 |
| 8.1.1 实验动物 |
| 8.1.2 主要试剂 |
| 8.1.3 主要仪器 |
| 8.2 实验方法 |
| 8.2.1 动物饲养及样本制备 |
| 8.2.2 样本总RNA制备 |
| 8.2.3 核酸琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 8.2.4 反转录 |
| 8.2.5 q-PCR检测 |
| 8.2.6 Western blot检测 |
| 8.3 实验结果 |
| 8.3.1 胚胎总RNA检测结果 |
| 8.3.2 胚胎SAS1B及相关基因表达结果 |
| 8.3.3 胚胎组织中SAS1B、Bard1、AuroraA蛋白表达 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 9 成年C57 BL/6小鼠不同组织SAS1B基因的表达研究 |
| 9.1 实验材料 |
| 9.2 主要仪器和设备 |
| 9.3 主要试剂 |
| 9.4 实验方法 |
| 9.4.1 组织总RNA制备(Trizol法) |
| 9.4.2 RNA浓度测定 |
| 9.4.3 逆转录 |
| 9.4.4 PCR检测 |
| 9.4.5 实时荧光定量PCR检测 |
| 9.5 实验结果 |
| 9.5.1 不同组织的SAS1B基因表达结果 |
| 9.5.2 SAS1B基因表达产物测序结果 |
| 9.5.3 不同组织中SAS1B荧光定量PCR结果 |
| 9.5.4 不同组织中SAS1B蛋白的表达 |
| 9.6 讨论 |
| 9.7 小结 |
| 10 结论 |
| 11 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）环状RNA circFGD4通过miR-532-3p/APC/β-catenin信号通路调控胃癌增殖、迁移及上皮间质转化的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 在胃癌中circFGD4 的表达及临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CircFGD4 在胃癌细胞的生物学特性及circFGD4 竞争性结合miR-532-3p的初步验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CircFGD4 竞争性结合miR-532-3p调控APC表达进而抑制β-catenin信号影响胃癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 不足与展望 |
| 文献综述:circRNAs在胃癌中的发生,功能及临床意义 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）miR-21/PTEN/Akt通路在姜黄素抗胃癌中的作用以及PD98059的抗胃癌协同效应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一章 PD98059协同姜黄素抗人胃癌MGC-803细胞增殖、诱导细胞凋亡以及PTEN抑制剂对姜黄素抑制MGC-803细胞迁移能力的影响观察 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 姜黄素与PD98059联合作用对MGC-803细胞miR-21表达的影响 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 姜黄素诱导MGC-803细胞凋亡过程中PTEN、p-Akt变化及姜黄素与PD98059联合作用对上述蛋白表达的影响 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 miR-21与靶基因PTEN关系的初步验证 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 姜黄素对MNNG诱导胃粘膜上皮细胞GES-1恶性转化的影响 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 致谢 |
| 成果 |
（7）去氢骆驼蓬碱调控PI3K/Akt通路和溶酶体Rab7/RILP诱导Sf9细胞自噬（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 1 前言 |
| 1.1 β-咔啉生物碱 |
| 1.1.1 β-咔啉生物碱的概述 |
| 1.1.2 β-咔啉生物碱的抗肿瘤活性 |
| 1.1.3 β-咔啉生物碱在植物保护领域的应用 |
| 1.1.4 去氢骆驼蓬碱抗肿瘤的机制研究 |
| 1.2 细胞自噬的概述 |
| 1.2.1 细胞程序性死亡的方式 |
| 1.2.2 细胞自噬的分类 |
| 1.2.3 细胞自噬的发生 |
| 1.2.4 自噬过程中的PI3K/Akt通路 |
| 1.2.5 自噬过程中溶酶体Rab7/RILP通路 |
| 1.3 选题依据及研究思路 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 去氢骆驼蓬碱对果蝇发育的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试果蝇品系 |
| 2.2.2 供试药剂及主要试剂 |
| 2.2.3 供试耗材及主要仪器 |
| 2.2.4 果蝇培养 |
| 2.2.5 剂量筛选处理 |
| 2.2.6 Harmine处理实验 |
| 2.2.7 果蝇发育相关基因q RT-PCR检测 |
| 2.2.8 统计学方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同浓度去氢骆驼蓬碱对果蝇生长发育的影响 |
| 2.3.2 去氢骆驼蓬碱对果蝇生长发育的影响 |
| 2.3.3 去氢骆驼蓬碱对果蝇生长发育和自噬相关基因的影响 |
| 2.4 小结 |
| 3 去氢骆驼蓬碱等五种β咔啉生物碱的细胞活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 供试细胞株系 |
| 3.2.2 供试药剂及主要试剂 |
| 3.2.3 供试耗材及主要仪器 |
| 3.2.4 昆虫细胞培养及保存 |
| 3.2.5 细胞毒力检测方法 |
| 3.2.6 倒置相差显微镜形态观察 |
| 3.2.7 透射电子显微镜形态观察 |
| 3.2.8 MDC荧光染色检测方法 |
| 3.2.9 Lyso Tracker Red荧光染色检测方法 |
| 3.2.10 细胞自噬相关基因的qRT-PCR检测 |
| 3.2.11 细胞自噬相关蛋白的Western Blot检测 |
| 3.2.12 统计学方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 五种β-咔啉生物碱对Sf9细胞增殖生长的影响 |
| 3.3.2 五种β-咔啉生物碱的对Sf9细胞形态的影响 |
| 3.3.3 β-咔啉生物碱对Sf9细胞亚细胞结构的影响 |
| 3.3.4 β-咔啉生物碱对Sf9 细胞MDC染色的影响 |
| 3.3.5 β-咔啉生物碱对Sf9 细胞Lyso Tracker Red染色的影响 |
| 3.3.6 β-咔啉生物碱对Sf9细胞自噬相关基因表达的影响 |
| 3.3.7 β-咔啉生物碱对Sf9细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 小结 |
| 4 去氢骆驼蓬碱诱导Sf9细胞自噬中的组学关联分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 供试药剂及主要药剂 |
| 4.2.2 供试耗材及主要仪器 |
| 4.2.3 倒置相差显微镜IPCM形态观察 |
| 4.2.4 MDC荧光染色检测方法 |
| 4.2.5 Lyso Tracker Red荧光染色检测方法 |
| 4.2.6 细胞自噬相关基因的qRT-PCR检测 |
| 4.2.7 细胞自噬相关蛋白的Western Blot检测 |
| 4.2.8 细胞转录组的检测 |
| 4.2.9 蛋白质iTRAQ定量检测 |
| 4.2.10 转录组与蛋白组的关联分析 |
| 4.2.11 统计学方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同浓度去氢骆驼蓬碱对Sf9细胞形态的影响 |
| 4.3.2 不同浓度去氢骆驼蓬碱对Sf9细胞MDC染色的影响 |
| 4.3.3 不同浓度去氢骆驼蓬碱对Sf9 细胞Lyso Tracker Red染色的影响 |
| 4.3.4 不同浓度去氢骆驼蓬碱对Sf9细胞相关基因表达的影响 |
| 4.3.5 不同浓度去氢骆驼蓬碱对Sf9细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 4.3.6 去氢骆驼蓬碱处理Sf9细胞后转录组结果分析 |
| 4.3.7 去氢骆驼蓬碱处理Sf9细胞后蛋白组结果分析 |
| 4.3.8 去氢骆驼蓬碱处理Sf9细胞后转录组和蛋白组关联结果分析 |
| 4.4 小结 |
| 5 PI3K/Akt通路参与去氢骆驼蓬碱诱导的Sf9 细胞自噬 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 供试药剂及主要药剂 |
| 5.2.2 供试耗材及主要仪器 |
| 5.2.3 细胞毒力MTT检测方法 |
| 5.2.4 倒置相差显微镜IPCM形态观察 |
| 5.2.5 MDC荧光染色检测方法 |
| 5.2.6 Lyso Tracker Red荧光染色检测方法 |
| 5.2.7 统计学方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 通路抑制剂与激活剂对去氢骆驼蓬碱诱导细胞形态变化的影响 |
| 5.3.2 通路抑制剂与激活剂对去氢骆驼蓬碱诱导细胞增殖抑制的影响 |
| 5.3.3 通路抑制剂与激活剂对去氢骆驼蓬碱诱导细胞MDC染色的影响 |
| 5.3.4 通路抑制剂与激活剂对去氢骆驼蓬碱诱导细胞Lyso Tracker染色的影响 |
| 5.4 小结 |
| 6 溶酶体Rab7/RILP通路在Sf9 细胞自噬中的作用方式 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 供试药剂及主要试剂 |
| 6.2.2 供试耗材及主要仪器 |
| 6.2.3 线粒体膜电位Rhodamine123 染色 |
| 6.2.4 线粒体Mito Green染色 |
| 6.2.5 线粒体ATPase的检测 |
| 6.2.6 溶酶体Cathepsin L与自噬Atg8 的免疫荧光检测 |
| 6.2.7 溶酶体Rab7/RILP通路的生物信息学分析 |
| 6.2.8 Rab7和RILP全长、截短和定点突变 |
| 6.2.9 溶酶体Rab7和RILP的过表达实验 |
| 6.2.10 溶酶体Rab7和RILP的 RNAi干扰实验 |
| 6.2.11 Rab7 的表达与RILP的截短表达 |
| 6.2.12 Rab7与RILP蛋白互作的酵母双杂交检测 |
| 6.2.13 Rab7与RILP蛋白互作的GST-pull down检测 |
| 6.2.14 统计学方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 去氢骆驼蓬碱对细胞线粒体膜电位Rhodamine123 染色的影响 |
| 6.3.2 去氢骆驼蓬碱对细胞线粒体Mito Green染色的影响 |
| 6.3.3 去氢骆驼蓬碱对细胞线粒体ATPase的影响 |
| 6.3.4 去氢骆驼蓬碱处理后Cathepsin L与 Sf-Atg8 的免疫荧光共定位 |
| 6.3.5 草地贪夜蛾溶酶体Rab7和RILP的生物信息学分析 |
| 6.3.6 Rab7和RILP过表达对去氢骆驼蓬碱诱导Sf9 细胞自噬的影响 |
| 6.3.7 RNAi干扰Rab7和RILP对去氢骆驼蓬碱诱导Sf9 细胞自噬的影响 |
| 6.3.8 定点突变和截短表达对Rab7和RILP互作酵母双杂交的影响 |
| 6.3.9 截短表达对Rab7和RILP相互作用GST-pull down的影响 |
| 6.4 小结 |
| 7 讨论与结论 |
| 7.1 讨论 |
| 7.1.1 β-咔啉生物碱生物活性与结构优化的关系 |
| 7.1.2 自噬与活性成分杀虫机理研究 |
| 7.1.3 生长发育信号网络与harmine诱导的果蝇生长发育抑制 |
| 7.1.4 细胞程序性死亡与果蝇生长发育 |
| 7.1.5 组学关联分析在昆虫研究中的应用 |
| 7.1.6 PI3K/Akt通路在去氢骆驼蓬碱诱导的Sf9 细胞自噬中的作用 |
| 7.1.7 哺乳动物细胞自噬中Rab7与RILP的相互作用 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 本文创新之处 |
| 7.4 本文后续研究思路 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 在读期间发表论文及获奖情况 |
（8）新型c-Met ADC SHR-A1403制备工艺、药效学及药代动力学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1.癌症流行病学 |
| 2.癌症治疗手段 |
| 2.1 .化疗 |
| 2.1.1 .常用化疗药物 |
| 2.1.2 .化疗药物临床疗效 |
| 2.1.3 .化疗药物副作用 |
| 2.2 .靶向治疗 |
| 2.2.1 .受体酪氨酸激酶RTK |
| 2.2.2 .靶向RTK药物的研发进展 |
| 2.2.3 .靶向c-Met的药物研发进展 |
| 3.抗体-药物偶联物(ADC) |
| 3.1 .ADC的作用机制 |
| 3.2 .ADC药物设计策略 |
| 3.2.1 .抗原选择性 |
| 3.2.2 .连接子(Linker) |
| 3.2.3 .毒素 |
| 3.2.4 .偶联技术 |
| 3.2.5 .药物-抗体比(DAR) |
| 3.3 .ADC药物研发进展 |
| 3.3.1 .Trastuzumab emtansine |
| 3.3.2 .Inotuzumab ozogamicin |
| 3.3.3 .Sacituzumab govitecan |
| 3.4 .c-Met ADC ABBV-399 研发进展 |
| 3.5 .本文选题依据及设计思路 |
| 第一章 SHR-A1403制备工艺研究 |
| 1.SHR-A1403裸抗制备工艺研究 |
| 1.1 .SHR-A1403裸抗制备工艺路线 |
| 1.1.1 .种子复苏与扩增 |
| 1.1.2 .大规模细胞培养(100L) |
| 1.1.3 .细胞收获与过滤 |
| 1.1.4 .亲和层析 |
| 1.1.5 .低pH病毒灭活 |
| 1.1.6 .深层过滤 |
| 1.1.7 .阴离子层析 |
| 1.1.8 .阳离子层析 |
| 1.1.9 .除病毒过滤 |
| 1.1.10 .超滤 |
| 1.1.11 .除菌过滤 |
| 1.2 .综合分析与评价 |
| 2.毒素SHR153024制备工艺研究 |
| 2.1 .制备工艺研究 |
| 2.1.1 .合成工艺 |
| 2.1.2 .样品精制方法及晶型研究 |
| 2.2 .结构确证 |
| 2.2.1 .高分辨质谱 |
| 2.2.2 .红外吸收光谱 |
| 2.2.3 .紫外吸收光谱 |
| 2.2.4 .氢核磁共振光谱(1H-NMR) |
| 2.2.5. ~(13)C核磁共振谱(13C-NMR) |
| 2.2.6 .X-射线粉末衍射谱 |
| 2.3 .综合分析与评价 |
| 3.SHR-A1403原液制备工艺研究 |
| 3.1 .SHR-A1403原液制备工艺 |
| 3.1.1 .SHR-A1403原液工艺路线 |
| 3.1.2 .SHR-A1403原液生产工艺 |
| 3.2 .综合分析与评价 |
| 4.本章小结 |
| 第二章 SHR-A1403药效学研究 |
| 1.实验方法 |
| 1.1 .试剂与仪器 |
| 1.1.1 .试剂 |
| 1.1.2 .仪器 |
| 1.2 .药物配制方法 |
| 1.2.1 .体外实验 |
| 1.2.2 .体内实验 |
| 1.3 .细胞来源及培养 |
| 1.4 .Biacore法检测体外亲和力 |
| 1.4.1 .SHR-A1403与c-Met蛋白的亲和力实验 |
| 1.4.2 .SHR-A1403与Fc受体(FcR)及C1q的亲和力实验 |
| 1.5 .肿瘤细胞系体外增殖实验 |
| 1.5.1 .SRB法 |
| 1.5.2 .CCK-8法 |
| 1.6 .细胞表面c-Met蛋白表达水平检测 |
| 1.7 .SHR-A1403与MKN-45 细胞亲和力实验 |
| 1.8 .Western blot |
| 1.9 .MKN-45细胞内吞实验 |
| 1.10 .MKN-45细胞溶酶体转运实验 |
| 1.11 .MKN-45细胞周期检测 |
| 1.12 .SHR-A1403在MKN-45 细胞中的代谢情况 |
| 1.12.1 .代谢产物鉴定 |
| 1.12.2 .代谢产物对细胞微管解聚的影响 |
| 1.13 .抗体依赖的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)实验 |
| 1.13.1 .ADCC实验 |
| 1.13.2 .CDC实验 |
| 1.14 .移植瘤小鼠抗肿瘤药效研究 |
| 1.14.1 .人肝癌HCCLM3移植瘤小鼠模型 |
| 1.14.2 .人胃癌MKN-45移植瘤小鼠模型 |
| 1.14.3 .人肺癌NCI-H1993移植瘤小鼠模型 |
| 1.15 .肝癌PDX模型抗肿瘤药效研究 |
| 2.结果与讨论 |
| 2.1 .SHR-A1403 与人和猴c-Met蛋白具有高亲和力 |
| 2.2 .SHR-A1403 可不同程度地抑制不同c-Met表达量的肿瘤细胞增殖 |
| 2.3 .SHR-A1403在小鼠移植瘤模型中发挥显着的抗肿瘤疗效 |
| 2.3.1 .SHR-A1403 在人肝癌HCCLM3 小鼠移植瘤模型中的抗肿瘤疗效研究 |
| 2.3.2 .SHR-A1403 在人胃癌MKN-45 小鼠移植瘤模型中的抗肿瘤疗效研究 |
| 2.3.3 .SHR-A1403 在人肺癌NCI-H1993 小鼠移植瘤模型中的抗肿瘤疗效研究 |
| 2.4 .SHR-A1403 在肝癌PDX模型中发挥显着的抗肿瘤疗效 |
| 2.5 .SHR-A1403抗肿瘤作用机制研究 |
| 2.5.1 .SHR-A1403与MKN-45 细胞的亲和力 |
| 2.5.2 .SHR-A1403对c-Met信号通路的影响 |
| 2.5.3 .MKN-45 细胞对SHR-A1403 的内吞 |
| 2.5.4 .SHR-A1403在MKN-45 细胞内的转运 |
| 2.5.5 .SHR-A1403对细胞周期的影响 |
| 2.5.6 .SHR-A1403对细胞内微管蛋白聚集的影响 |
| 2.5.7 .SHR-A1403在MKN-45 细胞中的代谢产物鉴定及对其微管蛋白聚集的影响 |
| 2.5.8 .SHR-A1403与Fc受体及C1q的亲和力 |
| 2.5.9 .SHR-A1403的ADCC及 CDC作用 |
| 3.本章小结 |
| 第三章 SHR-A1403药代动力学研究 |
| 1.实验方法 |
| 1.1 .试剂与仪器 |
| 1.1.1 .试剂 |
| 1.1.2 .仪器 |
| 1.2 .SHR-A1403在正常食蟹猴中的体内药动学实验 |
| 1.3 .食蟹猴血清中ADC及总抗体的ELISA检测方法 |
| 1.4 .食蟹猴血清中小分子毒素的LC-MS/MS检测方法 |
| 1.4.1 .色谱条件 |
| 1.4.2 .质谱条件 |
| 1.4.3 .血清样品处理方法 |
| 1.5 .食蟹猴血清中ADA的 ELISA检测方法 |
| 1.6 .药代动力学参数的计算方法 |
| 2.结果与讨论 |
| 2.1 .单、多次静脉注射SHR-A1403(DAR=2)在正常食蟹猴中的药动学研究 |
| 2.1.1 .单次给药 |
| 2.1.2 .多次给药 |
| 2.2 .不同DAR值的SHR-A1403 对正常食蟹猴中药代动力学特性的影响 |
| 2.3 .单、多次静脉注射SHR-A1403在正常食蟹猴中的免疫原性研究 |
| 3.本章小结 |
| 全文总结与讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文题录 |
| 附录 |
（9）基于网络药理学和蛋白质组学探究健脾复方胃肠安及活性化合物木犀草素的抗胃癌作用机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 复方胃肠安抗胃癌作用机制的网络药理学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 复方胃肠安组成成分及其作用靶标数据 |
| 1.1.2 疾病相关靶基因信息数据 |
| 1.1.3 靶标蛋白相互作用数据 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 复方胃肠安化合物化学成分的类药性快速评估 |
| 1.2.2 复方胃肠安活性成分作用靶标的筛选 |
| 1.2.3 复方胃肠安网络模型的构建 |
| 1.2.4 复方胃肠安靶标的生物功能富集 |
| 1.2.5 复方胃肠安网络药理学的化合物-靶标网络构建与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 复方胃肠安重要活性成分及复方靶标的筛选 |
| 2.2 复方胃肠安靶标网络的分析 |
| 2.3 复方胃肠安靶标的生物功能分析 |
| 2.3.1 基因本体(GO)富集分析 |
| 2.3.2 信号通路富集分析 |
| 2.3.3 疾病本体富集 |
| 2.3.4 主题词富集 |
| 2.4 复方胃肠安的网络药理学的化合物-靶标网络 |
| 3 讨论与小结 |
| 第二部分 复方胃肠安抗胃癌作用机制的蛋白质组学研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 复方胃肠安制备 |
| 1.1.2 细胞培养 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 主要实验试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 裸小鼠皮下移植瘤的建立 |
| 1.2.2 实验动物分组及给药 |
| 1.2.3 抑瘤率 |
| 1.2.4 组织样本的制备 |
| 1.2.5 差异蛋白的GO富集分析 |
| 1.2.6 差异蛋白的KEGG信号通路富集分析 |
| 1.2.7 复方胃肠安蛋白质组学的PPI网络的构建与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 复方胃肠安可抑制人胃癌裸小鼠皮下移植瘤生长 |
| 2.2 蛋白质控和蛋白定量 |
| 2.3 差异蛋白的鉴定 |
| 2.4 差异蛋白GO分析 |
| 2.5 差异蛋白KEGG信号通路分析 |
| 2.6 复方胃肠安蛋白质组学的PPI网络 |
| 3 讨论与小结 |
| 第三部分 复方胃肠安的网络药理学及蛋白质组学联合分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 网络药理学和蛋白质组学研究结果 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 复方胃肠安抗胃癌作用的重要化合物及核心靶点的筛选 |
| 1.2.2 潜在靶标的分子生物学验证 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 复方胃肠安抗胃癌作用的重要化合物及核心靶点 |
| 2.1.1 复方胃肠安网络药理学及蛋白质组学的网络映射 |
| 2.1.2 复方胃肠安网络中共表达的生信分析结果 |
| 2.1.3 差异蛋白与重要化合物共表达调控网络 |
| 2.1.4 复方胃肠安重要化合物及核心靶标 |
| 2.2 验证网络中潜在作用靶点 |
| 2.2.1 复方胃肠安可抑制人胃癌裸小鼠皮下移植瘤生长 |
| 2.2.2 网络药理学和蛋白质组学4个潜在靶标的Q-PCR验证 |
| 2.2.3 网络药理学和蛋白质组学4 个潜在靶标的Western-Blot验证 |
| 3 讨论与小结 |
| 第四部分 复方胃肠安活性化合物木犀草素抗胃癌机制的初步研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验药物 |
| 1.2 实验细胞及细胞培养 |
| 1.3 实验试剂与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞增殖实验 |
| 2.2 细胞周期实验 |
| 2.3 细胞凋亡实验 |
| 2.3.1 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.2 流式细胞术检测细胞线粒体膜电位 |
| 2.3.3 Hoechst染色检测细胞凋亡形态 |
| 2.4 Western Blot检测细胞内Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt、Caspase3、Cycs的蛋白表达 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 木犀草素对MKN45胃癌细胞增殖的影响 |
| 3.2 PI3K通路抑制剂LY294002对MKN45 胃癌细胞增殖的影响 |
| 3.3 木犀草素对MKN45胃癌细胞周期的影响 |
| 3.4 木犀草素对MKN45胃癌细胞凋亡的影响 |
| 3.5 木犀草素对MKN45胃癌细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.6 木犀草素对MKN45胃癌细胞形态的影响 |
| 3.7 木犀草素参与PI3K-Akt信号通路对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 3.8 木犀草素参与PI3K-Akt信号通路对凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 4 讨论与小结 |
| 讨论 |
| 1 健脾法在胃癌治疗中的作用 |
| 2 复方胃肠安的抗肿瘤作用机制的网络药理学研究 |
| 3 复方胃肠安从蛋白质组学与网络药理学结合分析抗胃癌的作用机制 |
| 4 木犀草素通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用 |
| 5 不足与展望 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 复方胃肠安136个活性化合物和306个核心靶标 |
| 附录二 文献综述 抗肿瘤中药复方的网络药理学研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录三 在校期间发表学术论文情况 |
| 附录四 参与的学术会议与获奖情况 |
（10）YAP1-AGK正反馈环路促进胃癌细胞进展的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 AGK在胃癌中的表达及其临床意义 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 AGK在胃癌中表达水平改变的分析 |
| 3.2 AGK在胃癌及癌旁组织中蛋白表达水平的差异 |
| 3.3 胃癌组织中AGK的表达水平与患者临床病理参数之间的关系 |
| 3.4 胃癌组织中AGK高表达患者预后不佳 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 AGK对人胃癌细胞生物学行为的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 瞬时转染效率检验 |
| 3.2 AGK促进胃癌细胞恶性增殖 |
| 3.3 AGK促进胃癌细胞侵袭和上皮-间质转化(EMT) |
| 3.4 裸鼠成瘤实验检验干扰AGK的表达对瘤体生长及Hippo-YAP通路的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分 AGK与 YAP1 之间关系及相互作用机制探讨 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 AGK与 YAP1 蛋白表达呈正相关 |
| 3.2 YAP1 正向调控AGK的表达 |
| 3.3 AGK是 YAP1/TEADs下游转录靶基因 |
| 3.4 YAP1/TEADs通过TEAD结合位点1(TRE1)与AGK启动子结合 |
| 3.5 AGK抑制Hippo-YAP1 信号通路提高TEADs转录活性 |
| 3.6 AGK过表达能缩短LATS1/2 蛋白的半衰期 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的主要成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、人胃癌相关蛋白VRG107基因的扩增及组织表达初步研究（论文参考文献）
- [1]基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响[D]. 李玲. 甘肃中医药大学, 2021(01)
- [2]DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制[D]. 夏红. 南华大学, 2020
- [3]新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究[D]. 李亚. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]新癌—卵基因SAS1B在人胃癌和甲状腺癌中表达及生物学意义研究[D]. 杨宏新. 内蒙古农业大学, 2020(01)
- [5]环状RNA circFGD4通过miR-532-3p/APC/β-catenin信号通路调控胃癌增殖、迁移及上皮间质转化的机制研究[D]. 代行龙. 重庆医科大学, 2020(01)
- [6]miR-21/PTEN/Akt通路在姜黄素抗胃癌中的作用以及PD98059的抗胃癌协同效应[D]. 强占荣. 南方医科大学, 2019
- [7]去氢骆驼蓬碱调控PI3K/Akt通路和溶酶体Rab7/RILP诱导Sf9细胞自噬[D]. 崔高峰. 华南农业大学, 2019
- [8]新型c-Met ADC SHR-A1403制备工艺、药效学及药代动力学研究[D]. 杨昌永. 东南大学, 2019(01)
- [9]基于网络药理学和蛋白质组学探究健脾复方胃肠安及活性化合物木犀草素的抗胃癌作用机制[D]. 丁亚杰. 上海中医药大学, 2019
- [10]YAP1-AGK正反馈环路促进胃癌细胞进展的分子机制[D]. 黄姗姗. 南昌大学, 2019(01)