一、CpGODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠（论文文献综述）
夏猛,孙玉浩,王萌,冷静[1]（2021）在《原发性肝癌常见动物模型的研究进展》文中研究表明原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,由于其治疗上的困难性和复杂性,采用动物模型来研究其发病机制和筛选药物是当前研究的热点,为研究者更清楚了解不同动物模型的特点及适用性。综述了小鼠、大鼠、兔、树闙等常用的实验动物及建模方法,包括自发型、诱发型、移植型和基因修饰型等,综合文献研究可见,肝癌模型各有特点,当依据实际需要选用合适的模型,其中在中医药研究中,诱发型动物模型较为常用。在模拟人体遗传等因素发病方面,转基因模型无疑是一个很好的模式生物研究平台。为开展肝癌模型研究或者药物筛选研究提供文献参考依据。
李涛[2]（2020）在《ADAR1通过对COX18和MAVS基因进行RNA编辑影响HBV表达机制的研究》文中认为研究目的乙型肝炎病毒感染是全世界重要的卫生问题,中国是乙肝高发国家,HBV携带者有近一亿人,其中约有三千万为慢性乙型肝炎患者,这是我国沉重的经济、社会和卫生负担。干扰素α具有抗病毒和免疫调节作用,是目前治疗乙肝的一线用药,但个体对IFNα的应答差异是影响IFNα临床用药的主要问题。ADAR1作为干扰素α下游重要调控基因具有广泛的RNA编辑功能,其对机体及病毒的基因有编辑调控作用。本实验室发现ADAR1的单核苷酸多态性与调控HBV复制有关联。本研究的目的是探讨ADAR1编辑功能和调控HBV复制的分子机制,以期能对提高HBV治疗效果提供新的潜在靶点。研究方法首先通过qPCR和WB方法检测在HepG2.2.15细胞中IFNα及ADAR1处理后影响相关基因和蛋白的表达变化。采用RIP实验和双荧光素酶报告基因实验,研究HepG2.2.15细胞中ADAR1调控COX18和MAVS表达的机制。在HepG2.2.15细胞和HBV-tg小鼠中确认MAVS和sh-COX18的抗病毒作用。采用Co-IP、荧光共定位和ELISA方法研究COX18对MAVS抗病毒信号通路的影响。应用ChIP、双荧光素酶报告基因实验和Co-IP实验探究HBc调控MAVS表达的分子机制。采用转录因子数据库预测MAVS启动子区域的结合因子。在CHB患者中,通过关联分析确认MAVS的基因多态性与IFNα治疗反应之间的关联。研究结果1)ADAR1可在mRNA和蛋白水平增强COX18表达（P<0.05）;2)ADAR1编辑COX18 3’UTR中chr4:73057732的位点,并通过HuR介导的转录后调节增强了 COX18的mRNA稳定性（P<0.05）;3)COX18可促HBsAg、HBV-DNA等标志物复制水平,敲低COX18表达可降低HepG2.2.15细胞和全长HBV-tg小鼠中HBV标志物水平（P<0.05）;4)COX18与MAVS的相互作用抑制了 MAVS与TRAF3的结合,导致IRF3的磷酸化衰减和IFNβ生产减少（P<0.05）;5)IFNα通过提高ADAR1的RNA编辑功能经HuR介导的转录后调控下调MAVS在mRNA和蛋白水平的表达（P<0.05）;6)在 C57BL/6J-Tg（Alb1HBV）44Bri/J 小鼠和全长 HBV-tg 小鼠中 MAVS 可抑制HBsAg、HBV-DNA等标志物复制水平,且通过联合应用IFNα抑制HBsAg、HBV-DNA等标志物复制效果显着增强（P<0.05）;7)HBc通过与转录因子SP1相互作用,抑制MVS启动子的活性,以调控MAVS的表达（P<0.05）;8)CHB患者MAVS基因3’UTR上rs3746662位点为A等位基因的人群其肝脏癌旁组织中具有较高的MAVS表达,且对IFNα治疗乙肝应答率更高（P<0.05）。研究结论1)ADAR1的RNA编辑作用通过HuR介导的转录后调控影响COX18和MAVS的mRNA稳定性,从而影响COX18和MAVS的表达水平;2)对COX18 mRNA的有效干扰可以降低HepG2.2.15细胞和全长HBV-tg鼠中的HBV复制水平,COX18通过与MAVS相互作用抑制细胞中MAVS介导的抗病毒信号通路;3)在HepG2.2.15细胞中IFNα通过ADAR1抑制MAVS的表达,在两种HBV转基因小鼠模型中联合应用MAVS和IFNα显示出比只施加IFNα更显着地抗HBV反应;4)HBc通过转录因子SP1调控MAVS启动子活性,抑制MAVS的表达;5)MAVS 3’UTR上位点的基因多态性影响汉族人群中干扰素治疗慢性乙型肝炎的应答。以上研究表明,ADAR1可通过调控COX18和MAVS的表达,对HBV的复制产生影响,为治疗乙肝提供了基于MAVS和COX18的新认识。
赵彬彬[3]（2019）在《从泛素蛋白酶体途径对TLR信号通路的调控研究补肾方的抗肝损伤机制》文中认为目的:从泛素蛋白酶体途径对TLR信号通路的调控研究补肾方的抗肝损伤机制。方法:研究分为两个部分,第一部分为补肾方抗肝损伤作用研究,第二部分为补肾方抗肝损伤的作用机制研究。第一部分补肾方抗肝损伤作用研究:将正常鼠、HBV转基因鼠各取35只,雌雄各半,随机分为正常组、模型组、补肾全方组和拆方组（补肾阴组、补肾阳组、清化湿热组、引经药组）。每天同一时间给药1次,连续一周给药,第7天给药结束4h后,各组小鼠（正常组除外）均尾静脉注射刀豆蛋白A 15mg/kg,18h后摘眼球处死老鼠。检测肝功能、肝脏病理组织学、外周血相关炎症因子。第二部分补肾方抗肝损伤的作用机制研究:将正常鼠、Nrdpl基因敲除鼠各取35只,雌雄各半,随机分为正常组、模型组、补肾全方组和拆方组（补肾阴组、补肾阳组、清化湿热组、引经药组）。造模给药方法同第一部分。ELISA法检测TLR信号通路介导的相关炎症因子,Westrn Blot法检测TLR通路中关键蛋白 TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、TRAF6、NF-kB、TRIP、MyD88 的表达。结果:第一部分补肾方抗肝损伤作用研究:1.对肝功能指标的影响。正常小鼠中补肾全组、补肾阴组、清化组的ALT均显着下降（P<0.001）;补肾全组的AST（P<0.05）、TBIL（P<0.05）和补肾阳组的 ALT（P<0.05）、AST（P<0.05）和清化组的TBIL（P<0.05）和引经药组的ALT（P<0.05）显着下降;补肾全组的 DBIL（P<0.01）、补肾阳组的 DBIL（P<0.01）、清化组的 DBIL（P<0.01）显着下降,补肾全组的ChE（P<0.01）显着升高;HBV转基因小鼠补肾全组的ALT（P<0.01）、TBIL（P<0.01）和补肾阳组的 ALT（P<0.01）和清化组的 ALT、DBIL（P<0.01）显着下降,补肾阴组的ChE（P<0.01）显着升高;补肾全组的AST（P<0.05）、DBIL（P<0.05）和补肾阴组的 ALT（P<0.05）、TBIL（P<0.05）和补肾阳组的DBIL（P<0.05）显着下降,补肾全组的ChE（P<0.05）显着升高。2对肝脏病理组织学的影响。正常小鼠与HBV转基因小鼠中补肾全组、补肾阳组中坏死区域的面积与模型组相比显着减小,其余给药组坏死区域的面积有所减小。3.对外周血相关炎症因子表达的影响。给药后,正常小鼠中补肾全组IL-1（P<0.05）、IL-6（P<0.05）、IFN-γ（P<0.05）,TNF-α（P<0.01）表达显着降低;补肾阳组IL-1（P<0.05）、IFN-γ（P<0.05）表达显着降低;补肾阴组IL-6（P<0.05）、IFN-γ（P<0.05）表达显着降低。HBV转基因小鼠中补肾全组IL-1（P<0.01）,TNF-α（P<0.05）、IL-6（P<0.05）表达显着降低;补肾阳组 IL-1（P<0.01）,TNF-α（P<0.05）表达显着降低;补肾阴组 IL-1（P<0.05）、IL-6（P<0.05）表达显着降低;清化组IL-1（P<0.05）、引经药组IL-1（P<0.05）表达显着降低。第二部分补肾方抗肝损伤的作用机制研究:1.对肝功能指标的影响。正常小鼠（Nrdp1未敲除）中补肾全组的ALT（P<0.001）表达显着下降,补肾全组的AST（P<0.01）、TBIL（P<0.01）,补肾阳组的 ALT（P<0.01）,补肾阴组的 ALT（P<0.01）表达显着下降;补肾全组的ChE（P<0.01）、补肾阴组的ChE（P<0.01）表达显着升高;补肾全组的 DBIL（P<0.05）,补肾阳组的 AST（P<0.05）、TBIL（P<0.05）,补肾阴组的 AST（P<0.05）、TBIL（P<0.05）、DBIL（P<0.05）,清化组的 ALT（P<0.05）、AST（P<0.05）、TBIL（P<0.05）、DBIL（P<0.05）以及引经组的ALT（P<0.05）表达显着降低;补肾阳组的ChE（P<0.05）,清化组的ChE（P<0.05）表达显着升高。Nrdp1敲除小鼠中补肾全组的ALT（P<0.001）表达显着下降,补肾全组的TBIL（P<0.01）,补肾阳组的ALT（P<0.01）,补肾阴组的ALT（P<0.01）,清化组的TBIL（P<0.01）表达显着下降;补肾全组的AST（P<0.05）、DBIL（P<0.05）,补肾阳组的 AST（P<0.05）、TBIL（P<0.05）,DBIL（P<0.05）,补肾阴组的 AST（P<0.05）、TBIL（P<0.05）、DBIL（P<0.05）,清化组的 ALT（P<0.05）、AST（P<0.05）、DBIL（P<0.05）以及ALT（P<0.05）表达显着降低;补肾全组的ChE（P<0.05）,补肾阳组的ChE（P<0.05）,补肾阴组的ChE（P<0.05）,清化组的ChE（P<0.05）表达显着升高。2.TLR信号通路介导的相关炎症因子表达。正常小鼠（Nrdp1未敲除）和Nrdp1敲除小鼠中补肾全组的TNF-α（P<0.0001）、IL-6（P<0.0001）、IL-1（P<0.0001）和 TNF-β（P<0.0001）显着降低,Nrdp1 敲除小鼠中补肾阳组的 IL-6（P<0.0001）、IL-1（P<0.0001）、TNF-β（P<0.0001）和清化组的 TNF-α（P<0.0001）、IL-6（P<0.0001）、IL-1（P<0.0001）表达均显着降低。正常小鼠（Nrdp1未敲除）中补肾阳组的TNF-α（P<0.001）、IL-6（P<0.001）和TNF-β（P<0.001）表达均显着降低。3.对TLR信号通路中关键蛋白的影响。正常小鼠（Nrdp1 未敲除）补肾全组中 TLR9（P<0.001）、TLR3（P<0.001）、NF-kB（P<0.0001）和 TLR4（P<0.0001）显着下降;补肾阳组中 TLR9（P<0.001）和MyD88（P<0.0001）显着下降;补肾阴组中 TLR3（P<0.001）、MyD88（P<0.001）、NF-kB（P<0.01）显着下降。Nrdp1敲除小鼠补肾全组中TLR4（P<0.001）、MyD88（P<0.001）,TLR3（P<0.01）和 NF-kB（P<0.01）显着下降;补肾阳组中 TLR4（P<0.001）、MyD88（P<0.01）和 TRAF6（P<0.05）显着下降;补肾阴组中MyD88（P<0.01）、NF-kB（P<0.01）显着下降。结论:1.补肾方具有显着抗肝损伤作用。2.拆方研究表明补肾阳组具有更好的降低ALT、AST、IL-1、TNF-α水平的作用,补肾阴组具有更好的升高ChE水平,降低IL-6、IFN-γ水平的作用,清化组具有更好的降低TBIL、DBIL水平的作用,说明不同拆方具有协同效应共同发挥抗肝损伤作用。3.Nrdp1基因敲除小鼠中,补肾方对TLR信号通路关键蛋白表达具有抑制作用,正常小鼠（Nrdp1未敲除）中,补肾方对TLR信号通路关键蛋白表达具有更强的抑制作用,可表明补肾方具有泛素连接酶样作用,通过泛素蛋白酶体途径调控TLR的炎症信号通路,最终实现其抗肝损伤效应。
王海刚[4]（2019）在《CS-γ-PGA纳米凝胶在HBV疫苗中的应用研究》文中指出研究背景:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是严重影响人类健康的全球性公共卫生问题。全世界有超过3.5亿人成为慢性HBV携带者。这一人群有更高的肝硬化和肝癌发病风险,每年超过100万人因此死亡。患者生活质量下降,预期寿命缩短。临床上治疗慢性HBV感染的药物主要有两大类:一类为抗病毒治疗药物,如核苷类药物;另一类为免疫治疗药物,如α-干扰素（IFN-α）。这些治疗药物存在种类少、高耐药、低耐受、难以彻底清除病毒、停药后易复发、不良反应多等诸多问题。接种乙型肝炎疫苗（HepB）是当前防控HBV感染最好的方法。我国自从1992年实施新生儿HepB预防接种策略以来成效显着,儿童乙肝发病率、HBV携带率有了明显的下降。但HepB应用中,一些不足也暴露出来。现有HepB为重组亚单位疫苗,免疫原性弱,需要添加铝佐剂。铝佐剂HepB需要进行三次免疫才能诱导产生有效的预防效果,耗时长、操作不利、易出现漏种。这在一定程度上限制了其有效推广。并且,铝佐剂HepB仅能够诱导体液免疫,诱导特异性抗体的产生。接种现有铝佐剂HepB尚有大约5-10%的人群不能有效产生抗体,仍然存在高HBV感染风险。因此,有效诱导CD8+T细胞免疫与B细胞免疫可以获得比现有疫苗体液免疫更高级的免疫保护。而且,越来越多铝佐剂相关的副作用被报道,例如无菌性脓肿、嗜酸性粒细胞增多、肌筋膜炎、肉芽肿形成和阿尔茨海默氏病等。因此,对现有HepB进行改良是非常必要的。在过去的十几年中,纳米技术在疫苗学中的应用呈指数增长,已形成了纳米疫苗学（nanovaccinology）。纳米制剂可从多个角度发挥免疫促进作用,促进抗原特异性免疫、免疫记忆诱导。另外,纳米制剂可以改变疫苗给药途径、给药方法、给药次数等,从多方面改良现有疫苗制剂。纳米凝胶（nanogel,Ng）性质稳定,易制备,具有高含水量、高荷载能力。CS为天然来源的正电荷多糖化合物,无毒、生物可降解、无免疫原性,是广泛应用的药剂敷料。γ-PGA是天然存在的水溶性、生物可降解、无毒化合物。CS与γ-PGA有望制备高HBsAg载量纳米凝胶,促进HBsAg疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫。另外,铝佐剂HepB不能有效诱导抗原特异性细胞免疫,一个重要的原因是铝佐剂会抑制DCs的白细胞介素12（interleukin-12,IL-12）分泌。IL-12能够显着促进NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞产生大量的IFN-γ,介导细胞免疫应答。也可以与B细胞相互作用,促进B细胞分化以及抗体产生。因此,IL-12对细胞免疫和体液免疫有明显的促进作用。但是IL-12价格昂贵且易发生不良反应。IL-12质粒（pIL-12）结构稳定,相对容易构建,易于大规模生产。纳米凝胶可以提高pIL-12体内稳定性和转染效率。pIL-12有望作为佐剂用于HBsAg疫苗。研究目的:研究分两部分,分别观察了纳米凝胶能否作为HBsAg载体增强HBsAg疫苗免疫效果,以及pIL-12是否可以作为佐剂提高HBsAg疫苗免疫效果。研究方法:1.利用CS、γ-PGA分别制备HBsAg纳米凝胶及pIL-12纳米凝胶,对纳米凝胶进行理化性质考察。2.取C57BL/6J小鼠分别腿部肌肉注射不同制剂免疫,定时取外周血测定anti-HBs水平,观察不同制剂、不同免疫方案对免疫效果影响。3.对不同免疫方案C57BL/6J小鼠尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2质粒进行攻击,定时测定攻击后小鼠血清HBsAg、anti-HBs水平,评价不同制剂免疫小鼠抗HBV感染能力。4.分别取肝脏、脾脏、淋巴结、外周血,提取淋巴细胞,进行流式细胞术测定免疫细胞比例、绝对数及细胞因子表达,评价不同免疫方案对小鼠免疫功能、免疫记忆的影响。研究结果:一、单剂量正电荷HBsAg纳米凝胶诱导长效免疫防御HBV感染的作用及机制研究1.调整CS与y-PGA 比例与加入顺序,可分别获得正电荷与负电荷纳米凝胶。正、负电荷纳米凝胶对HBsAg均有很好包封效率。2.HBsAg Ng（+）、HBsAg Ng（-）、市售乙肝疫苗三次免疫均能获得高水平anti-HBs表达,pAAV/HBV1.2质粒攻击后能够迅速清除病毒,恢复抗体表达,很好地预防HBV感染。3.单次免疫,仅HBsAg Ng（+）能够快速诱导HBsAg特异性抗体产生,对HBV感染发挥有效免疫防御作用,pAAV/HBV1.2质粒攻击后能够有效清除HBV感染、恢复抗体表达。HBsAg Ng（+）有望成为现有市售铝佐剂疫苗的改进。4.HBsAg Ng（+）能够促进DCs的成熟,并促进pAAV/HBV1.2质粒攻击后细胞免疫。与对照组相比,HBsAg Ng（+）组IFN-γ+CD8+T细胞比例显着上调、效应记忆T细胞比例显着增加。单剂量HBsAg Ng（+）免疫可以获得长效抗HBV感染保护。5.HBsAg Ng（+）、HBsAg Ng（-）三次免疫治疗CHB均可以显着促进HBsAg清除,增加IFN-γ+CD8+T细胞比例,但未观察到HBV特异性抗体产生。二、负电荷纳米凝胶荷载IL-12表达载体作为HBsAg疫苗佐剂诱导防御HBV感染免疫应答作用的研究1.研究采用诱导抗体水平较高的Ng（-）（pIL-12）进行。Ng（-）（pIL-12）对pIL-12有很好包封效率,肌肉注射能够有效促进IL-12分泌,增加小鼠血清IL-12p70水平。2.Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗免疫效果具有剂量相关性。高剂量Ng（-）（pIL-12）（75 μg）佐剂联合HBsAg疫苗三次免疫能够有效诱导anti-HBs表达,但是可能不利于HBsAg疫苗免疫后细胞免疫诱导,脾脏抗原特异性CD8+T细胞比例显着低于对照组。低剂量Ng（-）（pIL-12）佐剂（5μg）联合HBsAg疫苗免疫能够有效诱导体液免疫和细胞免疫,三次免疫能够快速清除HBV感染。3.5 pμg Ng（-）（μIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗免疫能够促进具有交叉提呈功能的CD8α+/CD103+ DCs成熟。在接受pAAV/HBV 1.2质粒攻击后,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗免疫小鼠,脾脏CD8α+ DCs的比例、绝对数明显上调,CD8α+ DCs上CD40、CD80、CD86的表达水平明显提高。CD103+DCs上也观察到了类似的现象。4.在接受ppAAV/HBV 1.2质粒攻击后,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HHsAg疫苗免疫小鼠体内巨噬细胞向M2极化受到抑制,高表达CD86,低表达M2型分子CD206。与对照组相比,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗组脾脏中MDSCs的比例有一定程度的降低。这些结果表明,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂在一定程度上能降低HBV感染诱导的免疫抑制。5.5μg Ng（-）（pIL-12）佐剂有利于HBsAg疫苗诱导抗原特异性CD4+T细胞产生。与对照组相比,5μgNg（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗免疫组可以观察到外周血高水平的抗原特异性CD4+T细胞,并高表达活性分子CD69。在pAAV/HBV 1.2质粒攻击后,与对照组相比,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗组小鼠脾脏中CD4+T细胞以及抗原特异性CD11ahiCD49dhi CD4+T细胞比例及其绝对数明显增加。6.5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗诱导机体产生抗HBV特异性CD8+T细胞。与对照组相比,5μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗免疫可以明显增加外周血抗HBV特异性的CD11ahi CD8αlo T细胞比例,并促进抗原特异性CD11ahi CD8αlo终末分化为短寿命效应细胞（SLECs）。在接受pAAV/HBV 1.2质粒攻击后,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗组脾脏中CD8+T细胞以及CD11ahi CD8ααl0T细胞的绝对数明显增加,并低表达免疫抑制分子LAG-3、TIGIT,处于活化状态。同时,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗组抗原特异性CD8+T细胞中SLECs比例明显增加,并高表达CD107a,低表达TIGIT,处于高度活化状态,有利于防止HBV再次感染。结论及研究意义:1.本研究证实,CS、y-PGA制备HBsAg Ng（+）单次免疫能够快速诱导抗HBV体液免疫和细胞免疫,可以获得长效抗HBV感染保护。2.本研究证实,CS、y-PGA制备Ng（-）（pIL-12）对HBsAg疫苗具有剂量相关性佐剂效果。5μg Ng（-）（pIL-12）佐剂有利于HBsAg疫苗诱导体液免疫和细胞免疫,快速清除HBV感染。这个过程中,APCs抗原提呈功能增强,抗原特异性CD4+T细胞和CD8+ T细胞增加,并促进抗原特异性CDllahiCD8αlo终末分化为SLECs,有利于防止HBV再次感染。3.我们的研究为预防性疫苗以及治疗性疫苗研究提供新的佐剂选择,并提供使用方法参考。
郝晓磊[5]（2019）在《新型HBV相关肝细胞癌小鼠模型的构建及其免疫致病机理探究》文中认为慢性HBV感染是全球一大公共健康问题,全球约2.6亿的人口面临着因慢性HBV感染导致的肝炎,肝纤维化,肝硬化以及肝癌的威胁。虽然目前已经开发出了预防性疫苗,可以有效的降低HBV新发感染的几率,但是在低收入国家预防性疫苗的普及率仍然很低。另外,针对慢性HBV病人尚未建立有效的治疗手段,通用的核苷类似物联合干扰素的治疗方法虽然可以有效地抑制病毒的复制,但是并不能彻底清除病毒,并且在停药后有明显的反弹现象,慢性HBV感染患者仍面临着发生肝癌的风险。因此,阐明慢性HBV感染导致肝癌发生的机制就尤为重要。HBV病毒可以通过宿主细胞基因整合而导致肝细胞中原癌基因的活化或者抑癌基因的失活进而导致细胞的恶性转化,同时机体免疫系统对被HBV感染的肝细胞的持续攻击会导致肝细胞的反复损伤和再生,免疫攻击也是致使肝细胞癌恶性转化的必要因素之一。HBV抗原特异性的CD8+T对被感染的肝细胞的攻击是导致免疫损伤的最主要的因素,但是因为没有合适的动物模型,目前还没有对这一免疫损伤过程进行深入细致的研究。本研究主要通过利用肝细胞替代技术建立了一种构建HBV小鼠模型的方法,用于HBV的免疫损伤研究,并获得了以下几项结果:1.利用肝细胞替代技术成功构建HBV相关肝癌小鼠模型。首先通过肝脏灌流的方法分离了 HBs转基因（HB s-Tg）小鼠和野生型（C57BL6/J）小鼠的肝实质细胞;然后使用脾内转输的方法把1.0×106肝实质细胞转输给8-12周龄免疫系统健全的Fah缺陷小鼠,进行肝细胞重建;撤去Fah缺陷小鼠的NTBC水供应,让受体小鼠肝实质细胞死亡,为供体小鼠肝细胞的生长提供空间。经过12周的肝细胞重建,我们可以成功构建HBs-Tg肝细胞取代小鼠（HBs-HepR）和其对照B6-HepR。HBs-HepR小鼠血清和组织中均可以检测到HBsAg表达。2.肝脏取代重建的HBs-HepR小鼠表现出慢性肝炎,肝纤维化和肝癌。相较于对照B6-HepR小鼠,当延长肝细胞的重建时间至18周后,HBs-HepR小鼠表现为ALT水平的升高,并在重建6个月后肝脏出现了纤维化。当重建到9个月后,所有的HBs-HepR小鼠肝脏中均出现肿瘤结节,经基因水平和组织水平的鉴定证实其为HCC,该HBV相关的HCC模型与已有的其他小鼠HCC模型不同,且与人HBV感染导致的HCC具有相同的分子表型。3.抗原特异性CD8+T细胞在HBV相关肝细胞癌发生发展中发挥关键作用。通过单细胞测序技术发现,在HBs-HepR小鼠肝脏中的CD8+T细胞发生了明显的活化,并且在免疫攻击的时间点有更多CD8+T细胞由naive表型向效应性表型转化。进一步我们通过流式细胞分析和免疫荧光检测验证了在HBs-HepR小鼠肝脏中存在HBsAg特异性CD8+T细胞,并且介导了肝细胞的凋亡。进一步通过抗体的清除和基因缺陷的方法,我们证明CD8+T细胞的缺失可以显着降低HCC的发生率。HBsAg致敏过的脾脏CD8+T细胞的回输可逆转HBs-HepR-CD8KO小鼠肝脏HCC的发生发展。4.在HBs-HepR小鼠介导的损伤中B细胞,CD4+T细胞和NK细胞不起关键作用。在HBs-HepR小鼠中不能产生针对HBsAg的抗体,甚至使用铝佐剂的HBsAg疫苗外周免疫攻击也不能产生Anti-HBs抗体,说明HBs-HepR小鼠的肝细胞损伤可能不是由B细胞产生的抗体导致的。而使用抗体清除CD4+T细胞或者NK细胞后,HBs-HepR小鼠仍然全部会发生HCC,与未清除组小鼠相比没有明显的变化,说明CD4+T细胞与NK细胞在HCC的发生发展中不起重要作用。5.在HBs-HepR成瘤小鼠肝脏中的T/NK细胞处于功能耗竭的状态。使用单细胞测序技术发现在形成肿瘤的HBs-HepR小鼠肝脏中T细胞和NK细胞的功能性分子IFN-γ等表达下降,同时利用流式细胞分析验证了这一现象。说明在发生肿瘤后,肿瘤微环境导致了肝脏内免疫细胞的功能耗竭促进了肿瘤的逃逸。6.利用HBV全基因转基因小鼠来源的肝实质细胞亦可建立HBV小鼠模型。当使用1.0×106个C57BL/6J背景的HBV全基因转基因小鼠来源的肝细胞进行模型构建时,我们也可以成功构建肝细胞替代的HBV小鼠模型（HBV-HepR）,在受体小鼠Fah缺陷的小鼠体内可以检测到HBcAgp阳性的肝细胞,并且在血清中可以检测到HBeAg,HBsAg以及HBV-DNA的表达。但是重建12个月后,的HBV-HepR小鼠模型并不会自发HCC。
袁伦志[6]（2019）在《人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究》文中指出乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染在全球范围内造成了严重的疾病负担。HBV感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,其感染人肝细胞后能够持续复制,诱发宿主免疫耐受状态、逐步形成慢性化、直接或间接诱导一系列病理生理学变化并造成重症肝炎、肝衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病。目前,虽然预防性疫苗的普及已经在很大程度上控制HBV新发感染率,但是已批准上市的临床药物仍然无法彻底清除病毒,实现功能性治愈。由于HBV的天然宿主人类和猩猩等大型灵长类动物用于研究收到严格的伦理限制,因此发展能够最大限度模拟HBV感染和发病的动物模型成为进一步认识HBV感染发病机制,以及研发和评价新一代抗HBV药物所面临的一项挑战。数十年来,研究人员建立了转基因小鼠、尾静脉高压注射小鼠、旱獭、北京鸭和树鼩等替代模型,然而它们都不能完全模拟HBV在人类中感染发病的自然史,因此,建立人源化小鼠动物模型,特别是人肝和人免疫系统双嵌合的人源化小鼠动物模型,用于支持HBV感染发病相关研究具有相当的重要性。然而,目前已有的人源化小鼠动物模型一直存在原代人细胞来源匮乏和体外难以扩增、个体差异大、多种细胞移植不匹配、伦理问题、造模周期长、实验窗口期短和难以模拟HBV感染相关的终末期肝脏疾病等限制。因此,建立一种方便易用的、能够支持HBV感染发病研究的新型人源化小鼠动物模型对于进一步推进HBV相关基础研究和治疗策略的发展十分必要。本论文中,我们利用临床分离的健康人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）在免疫缺陷小鼠体内同时重建了同源的人源肝脏和免疫系统,并将此种双嵌合人源化小鼠用于乙肝病毒感染及相关病理生理学研究。我们对乙肝病毒的生物学特征、流行病学、感染自然史、相关肝脏疾病、天然宿主动物、感染细胞和动物模型等方面进行综述研究,基于前期研究和对最新研究成果的考察,我们发现hBMSCs具有重建人类肝脏和免疫系统的巨大的潜力,并选择其作为我们构建新型双嵌合人源化小鼠模型的细胞材料。我们使用hBMSCs移植暴发性肝衰竭免疫缺陷FRGS小鼠,发现其能够在小鼠体内迅速转分化为具有活性的人肝细胞和多种人免疫细胞,同时证明暴发性肝衰竭的肝脏微环境是驱动hBMSCs在免疫缺陷FRGS小鼠体内大量快速转分化为人源肝细胞和免疫细胞的重要驱动因素。我们在hBMSCs移植的免疫缺陷FRGS小鼠（hBMSC-FRGS）体内建立了HBV慢性感染,实现A,B,C,D四种常见HBV基因型病毒感染超过50周。我们连续监测了 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内病毒DNA及蛋白水平,证明被HBV感染的小鼠血清内含有具备感染活力的HBV病毒颗粒。我们初步研究了HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内的免疫病理生理学变化,在感染进行和持续和过程中同步分析了小鼠肝内人源免疫细胞、人源细胞因子、肝脏炎症进展和HBV特异性人源抗体水平等指标,证明HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠出现持续的肝脏炎症和免疫耐受状态。我们在HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内观察到一系列的指示肝硬化发生发展的典型性指标,包括:肝硬化血清学指标持续增高、小鼠肝脏组织中肝硬化相关人源基因表达持续上调、小鼠肝脏组织中胶原纤维堆积持续增加、纤维结节生成、肝小叶结构被破环、肝板塌陷、肝脏外表粗糙体积固缩等。综上所述,我们建立了肝脏和免疫系统双重人源化的hBMSC-FRGS小鼠模型,将其用于HBV感染和相关免疫病理生理学研究,并通过长期观察发现HBV感染后小鼠产生肝脏炎症并且逐步发展为典型的肝硬化。
陈坤[7]（2017）在《肿瘤相关抗原GPC3特异性细胞免疫诱导进行原发性肝癌干预的研究》文中研究指明原发性肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是我国最为常见的恶性肿瘤之一,大量临床与流行病学研究资料表明:慢性乙肝病毒（Hepatititis B virus,HBV）感染是我国HCC发生的主要病因。已采取的乙肝疫苗免疫策略有效控制了 HBV的新发感染,但目前我国成年人群基本未接种乙肝疫苗,慢性HBV感染率仍高达5%以上;临床上采用的抗病毒疗法,虽然在部分患者体内能够有效控制HBV病毒复制,但是仍难以完全清除病毒,HCC发生风险仍然较高。目前采取的主要干预手段是对HCC发生的高危人群进行定期筛查,这一效果存在很大争议。因此,有必要研发针对HCC发生高危人群的其他相关干预手段。抗原特异性CD8+T细胞参与和介导的细胞免疫在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是HCC的一种重要肿瘤相关抗原。据统计,74%的HCC患者肿瘤组织高表达GPC3蛋白。有临床研究表明:HCC总生存率高的患者,其体内GPC3特异性CD8+T细胞比例显着增加。我们推测:在肝癌发生的高危人群中,通过诱导针对肿瘤相关抗原GPC3蛋白的特异性细胞免疫,增加抗原特异性CD8+T细胞比例,可清除GPC3表达的癌变肝细胞,有助于预防/延缓原发性肝癌发生。尽管正常成人肝细胞不表达GPC3蛋白,但它作为一种胚胎抗原,在胚胎发育时期表达于胎盘、胎肝和胎肾等组织中。因此,一般情况下肿瘤细胞高表达的GPC3抗原本身难以诱导抗原特异性细胞免疫产生。本研究以诱导GPC3抗原特异性CD8+T细胞参与为主的细胞免疫,清除GPC3表达的癌变的肝细胞,从而预防HCC的发生。我们过去的研究显示:TLR7/8激活剂（CL097）通过活化单核细胞源性的抗原提呈细胞,主要是单核源性的树突状细胞（moDCs）可有效增强蛋白疫苗的免疫原性,从而诱导出抗原特异性免疫应答。本研究中,利用HPLC/MS技术分析显示:联合CL097的蛋白疫苗能够显着上调moDCs中的MHC-I α链分子以及MHC-I类抗原提呈途径中TAP1/TAP2,Tapasin等与抗原胞内转运相关的蛋白分子的表达,从而为诱导抗原特异性CD8+T细胞的产生奠定了分子基础。我们以TLR7/8激活剂（CL097）作为疫苗佐剂,根据moDCs表面高表达甘露糖受体的特性,合成了具有moDCs靶向性纳米材料作为抗原递送载体、并包裹CL097为佐剂的GPC3复合纳米疫苗:简称为LP/Man-GPC3-CL097。研究结果显示:这一复合纳米疫苗LP/Man-GPC3-CL097可非常显着增加MHC-I分子的细胞膜表达,在吞噬相关抗原后,能促进moDC通过早期内涵体-内质网-高尔基体途径对抗原进行加工提呈,避免溶酶体对抗原的过度降解,从而可保证有效产生MHC-I/GPC3多肽复合物。上调moDC表面CD83、CCR7等分子的表达,促进DC成熟和淋巴结归巢能力。皮下注射LP/Man-GPC3-CL097后,能促进CD11c+细胞对抗原的摄取,并能够快速、有效靶向至局部引流淋巴结及肝脏组织内。在LP/Man-GPC3-CL097免疫的正常C57BL/6J小鼠体内,可检测到GPC3特异性IFN-γ产生型CD8+T细胞,肝脏浸润的T淋巴细胞分泌大量IFN-y和颗粒酶B等效应分子。体外杀伤实验显示:这些浸润的T细胞能有效杀伤GPC3表达型小鼠肝癌细胞系Hepa1-6。进而,我们探讨了该复合型疫苗在预防原发性肝癌发生中的作用。以C57BL/6背景的雄性HBV转基因（HBV-Tg）小鼠为研究材料,于小鼠出生后2周龄时,按每克体重腹腔注射25μg二乙基亚硝胺（DEN,diethylnitrosamine）,诱导肝细胞癌变,在小鼠8周龄尚未形成显微镜下可见的肝癌细胞团时,每隔两周皮下注射LP/Man-GPC3-CL097进行免疫,以LP/Man作为对照组,连续免疫4次。在小鼠22周龄时处死小鼠,结果显示LP/Man-GPC3-CL097免疫组（n=9）小鼠肝脏肿瘤数目显着减少（P<0.01）,特别是结节直径≤1mm（P<0.05）的肿瘤数量显着减少;进一步分析发现:联合CL097的GPC3复合疫苗免疫后,小鼠肝脏浸润的IFN-γ产生型CD8+T细胞比例增加,且分泌的IFN-γ和颗粒酶B含量也明显升高。结论:以TLR7/8激活剂为佐剂的GPC3复合型纳米疫苗能够促进树突状细胞对抗原的摄取及树突状细胞的成熟,诱导GPC3特异性细胞免疫,在DEN诱导的HBV转基因背景的小鼠原发性肝癌模型中能够有效预防/延缓原发性肝癌的发生。
薛萌[8]（2015）在《HepG2.2.15细胞来源的自噬小体疫苗（HBV+DRibbles）防治HBV感染及其免疫机制的实验研究》文中研究说明抗原的交叉递呈对于诱导肿瘤或病毒特异性免疫应答至关重要。我们前期研究证实：来源于肿瘤细胞的自噬小体（DRibbles）是肿瘤抗原的有效载体,能充分激活树突状细胞（DC）并显着提高其交叉递呈肿瘤抗原的能力,进而诱导具有治疗效果的抗肿瘤免疫应答。肿瘤细胞的DRibbles目前已进入临床应用研究。HBV主要感染肝细胞,由于肝细胞缺乏共刺激分子,直接提呈HBV抗原途径不能有效诱导CD8+T细胞的活化；因此,专职抗原递呈细胞的交叉提呈被普遍认为是诱导HBV特异性CD8+T细胞应答的重要途径。在慢性HBV感染过程中,机体存在HBV特异性免疫应答能力的受损状态,而感染机体针对HBV抗原缺乏有效的交叉递呈可能是引起HBV感染慢性化的原因之一。本研究拟提取转染HBV全长基因组的HepG2.2.15细胞的自噬小体（HBV+ DRibbles）,探讨HBV+ DRibbles疫苗对HBV感染的预防和治疗效果及其免疫机制。目的以HepG2.2.15细胞来源的自噬小体作为HBV疫苗,以高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒的C57BL/6小鼠作为HBV感染的动物模型,探讨HBV+ DRibbles疫苗对HBV感染的预防和治疗作用及其免疫机制。方法1.HBV+ DRibbles的制备和鉴定1.1不同药物（Rapamycin, Bortezomib, NH4CI）处理对数生长期HepG2.2.15细胞,差速离心法提取自噬小体（HBV+ DRibbles）;1.2 Western blot法检测不同药物处理组的HepG2.2.15细胞裂解液中HBsAg、LC3的水平以及HBV+ DRibbles中LC3的水平；1.3透射电子显微镜观察HBV+ DRibbles的形态；1.4 ELISA法检测HBV+ DRibbles中HBV抗原的相对含量。2.HBV+ DRibbles诱导DC细胞交叉递呈HBV抗原的实验研究重组HBsAg蛋白疫苗免疫野生型（Wild type,WT） C57BL/6小鼠,以表面抗体（anti-HBs）阳性小鼠的淋巴细胞作为HBsAg特异性细胞,体外用HBV+ DRibbles和HBsAg再刺激,ELISA法检测培养上清中IFN-y的含量；进一步分选出HBsAg特异性的CD4+和CD8+T细胞,体外分别用HBV+ DRibbles、HBsAg负载的DC细胞再刺激,ELISA法检测培养上清中IFN-y的含量。3. HBV+ DRibbles疫苗诱导HBV特异性细胞免疫应答的实验研究以不同剂量的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,并设HBV-DRibbles疫苗对照组。于免疫第8天,体外HBV抗原及抗原肽再刺激小鼠淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量。4.HBV感染小鼠模型的建立以文献中报道的方法将pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WT C57BL/6小鼠,于质粒注射后不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBV抗原的相对含量,荧光定量PCR法检测血清HBVDNA的拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST的水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达,HE染色法观察肝组织的病理变化。5. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的实验研究以不同剂量的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,第8天高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒。于免疫14天后ELISA法检测血清HBeAg水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例。6. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的机制研究6.1以30μg的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,第8天高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒,同时设未免疫PBS对照组。在质粒注射同一天,疫苗免疫小鼠腹腔分别注射单克隆抗体,分组如下：注射PBS组、注射αCD4单克隆抗体组、注射αCD8单克隆抗体组、注射αCD4+αCD8单克隆抗体组。于免疫后第14天,ELISA法检测血清HBeAg水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例；6.2以HBV+DRibbles疫苗免疫WT C57BL/6小鼠的效应淋巴细胞与质粒注射小鼠的肝细胞共孵育,同时设正常小鼠的肝细胞作为对照。分别于培养不同时间点采用全自动生化仪酶法检测培养上清中ALT、AST的水平,ELISA法检测培养上清中IFN-γ的含量。7. HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染的实验研究pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WTC57BL/6小鼠,以小鼠感染HBV的初期模拟急性HBV感染阶段。7.1于质粒注射第3、5、7天,HBV+ DRibbles疫苗免疫HBV急性感染小鼠,并设PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组。于首次免疫第8天,HBV抗原及抗原肽体外再刺激淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量；7.2相同分组与免疫,于免疫后不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBeAg、HBsAg、抗HBs抗体水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例、HE染色观察肝组织的病理变化。8. HBV+ DRibbles疫苗治疗慢性HBV感染的实验研究pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WT C57BL/6小鼠,以持续感染HBV达60天后的HBsAg耐受小鼠作为HBV慢性感染模型。8.1 HBsAg耐受小鼠的判定WT C57BL/6小鼠分为两组,一组按照前述方法建立模型,于质粒注射后第61、63、65天,重组HBsAg蛋白疫苗免疫HBsAg阳性小鼠；另一组小鼠按相同方案免疫。两组小鼠于免疫后第14天,ELISA法检测血清抗HBs抗体水平；8.2耐受小鼠以血清HBsAg水平分组,设HBV+ DRibbles疫苗免疫组、PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组。于质粒注射第61、63、65天免疫治疗。于首次免疫第8天,HBV抗原及抗原肽体外再刺激淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量；8.3相同分组与免疫,于首次免疫第8天,收获淋巴细胞,分别尾静脉过继转移到新一批慢性HBV感染小鼠及对照组小鼠体内。于过继转移后的不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBsAg、anti-HBs抗体水平,荧光定量PCR法检测HBV DNA拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例、HE染色观察肝组织的病理变化。结果1. HBV+ DRibbles的制备和鉴定1.1差速离心法提取不同药物处理组的HBV+ DRibbles,分装,-20℃保存；1.2各组细胞裂解液中均检测到分子量26KD的HBsAg的表达,3种药物联合处理组含量最高；加入Bortizomib组均出现分子量<26KD的HBsAg小片段,3种药物联合处理组的小片段更为明显。各组细胞裂解液中均检测到自噬特异性标记物LC3分子,以胞浆型LC3-Ⅰ为主,3种药物联合处理组中LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ含量最高；各组HBV+ DRibbles中均检测到自噬特异性标记物LC3分子,且以膜结合型LC3-Ⅱ为主,3种药物联合处理组LC3-Ⅱ含量最高；1.3 3种药物联合处理组的HepG2.2.15细胞自噬小体（HBV+DRibbles）,具有双层膜结构,直径100-1000nm；1.4与培养液对照组相比,3种药物联合处理组的HBV+ DRibbles中HBsAg和HBeAg含量明显升高。2. HBV+ DRibbles诱导DC细胞交叉递呈HBV抗原的实验研究HBV+ DRibbles作为富集HBV抗原的载体,体外再刺激HBsAg特异性淋巴细胞,与HBsAg蛋白刺激组相比,培养上清中能够产生更高水平的IFN-γ,差别具有统计学意义。进一步用HBV+ DRibbles、HBsAg负载的DC细胞再刺激HBsAg特异性CD4+、CD8+T细胞,与未负载抗原的对照组及负载HBsAg的DC细胞刺激组相比,负载HBV+ DRibbles的DC细胞刺激组均产生了更高水平的IFN-γ,差别具有统计学意义。3. HBV+DRibbles疫苗诱导HBV特异性细胞免疫应答的实验研究不同剂量的HBV+ DRibbles及HBV- DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,效应淋巴细胞经HBV抗原及抗原肽再刺激,与其他剂量组相比,30μg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg及HBcAg特异性IFN-γ的细胞数量最高,差别具有统计学意义；与未免疫的PBS对照组相比,10μg与100μg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg及HBcAg特异性IFN-γ的细胞数量均未见明显统计学差异；30νg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg、HBcAg及相关肽特异性IFN-γ的细胞数量明显高于30μg HBV- DRibbles免疫组,差别具有统计学意义。4.HBV感染小鼠模型的建立以文献报道的方式,复建HBV感染的小鼠模型,于质粒注射后不同时间点,检测小鼠HBV感染状态。与未注射对照组及PBS注射对照组相比,质粒注射组小鼠血清ALT水平均未见明显统计学差异；而AST水平只在质粒注射后第3天显着高于未注射对照组,其余时间点未见明显差异。质粒注射第3天,所有小鼠血清均可检测到较高水平的HBsAg及HBeAg含量,随着观察时间的延长,含量逐渐降低；至第63天,部分小鼠血清中HBsAg及HBeAg已经低于检测下限。质粒注射第3天,所有小鼠血清均可检测到较高的HBV DNA水平（180.9±98.61×104 copies/ml）,至第63天,HBsAg阳性小鼠的血清仍可检测到HBV DNA （102×104,34.1×104 copies/ml）。质粒注射第3天,WT小鼠的肝组织结构正常,无病变；PBS注射组可见轻度的点状或小灶状坏死,局部可见少量中性粒细胞和单核-巨噬细胞的浸润；质粒注射组小鼠的肝细胞出现中度坏死,中央静脉区可见少量中性粒细胞浸润,至第7天,肝脏组织结构基本恢复正常,至第63天,亦未见明显病变。质粒注射第63天,HBsAg阳性小鼠的肝细胞中可检测到HBcAg表达,HBcAg既可分布于细胞浆,亦可分布于细胞核。5. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的实验研究不同剂量的HBV+ DRibbles及HBV- DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,于第8天注射质粒。质粒注射后不同时间点,与其他剂量组相比,30μgHBV+ DRibbles免疫组的小鼠血清HBeAg水平、HBV DNA拷贝数、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均显着降低,具有统计学差异。与未免疫的PBS对照组相比,10μg、100μg HBV+ DRibbles疫苗及HBV- DRibbles疫苗免疫组的小鼠上述指标均未见明显变化。6. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的机制研究6.130μg HBV+ DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,设PBS对照组；第8天注射质粒,同时免疫组小鼠腹腔注射单克隆抗体以清除相应T细胞。结果可见：与PBS对照组相比,未清除T细胞的HBV+ DRibbles免疫组小鼠血清HBeAg水平、HBV DNA拷贝数及肝细胞HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均显着下降；只清除CD8+T细胞的免疫组小鼠上述指标与PBS对照组相比,未见明显统计学差异；同时清除CD4+和CD8+T细胞的免疫组小鼠上述指标相对于只清除CD8+T细胞的免疫组,差异无统计学意义；6.2 HBV+ DRibbles疫苗免疫小鼠的效应淋巴细胞与质粒注射小鼠的肝细胞共孵育,结果可见：与正常肝细胞共孵育组相比,免疫小鼠淋巴细胞与HBV感染的肝细胞共孵育组培养上清中ALT、AST水平均升高,ALT水平未见统计学差异,而AST水平具有明显统计学差异；同时培养上清中产生了更高水平的IFN-γ,差异具有统计学意义。7. HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染的实验研究7.1以HBV+ DRibbles疫苗免疫急性HBV感染小鼠,效应淋巴细胞体外经HBV抗原及抗原肽再刺激。结果可见：与PBS对照组及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组相比,HBV+ DRibbles疫苗免疫诱导分泌针对HBV抗原及抗原肽特异性IFN-γ的细胞数量明显增高,差别有统计学意义；而HBsAg免疫组未能诱导产生分泌IFN-γ的细胞；7.2 HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染小鼠。结果可见：与PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫的对照组相比,只有HBV+ DRibbles疫苗免疫能够明显降低小鼠血清HBeAg、HBsAg、HBVDNA水平、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例；而小鼠血清HBsAg的水平明显低于PBS对照组,高于HBsAg免疫组；部分小鼠血清产生抗HBs抗体,但平均水平明显低于HBsAg免疫对照组；且小鼠血清ALT、AST水平未见明显变化,肝组织结构基本正常,仅有少量炎细胞浸润。8. HBV+DRibbles疫苗治疗慢性HBV感染的实验研究8.1经重组HBsAg蛋白疫苗免疫后,WT小鼠血清产生了高水平的anti-HBs抗体,而pAAV/HBV1.2质粒注射后60天的模型小鼠血清中anti-HBs抗体阴性；8.2 HBV、DRibbles疫苗免疫HBsAg耐受小鼠,同时设PBS及HBsAg蛋白疫苗免疫对照组,体外HBV抗原及抗原肽再刺激各组小鼠效应淋巴细胞。结果可见：与PBS对照组相比,只有HBV+DRibbles疫苗免疫组小鼠的淋巴细胞在HBV抗原及抗原肽再刺激时,能够产生更高水平分泌IFN-γ的细胞数量,差异具有统计学意义；而重组HBsAg蛋白疫苗免疫组的小鼠淋巴细胞在HBV抗原及抗原肽再刺激后,分泌IFN-γ的细胞数量未见明显统计学差异；8.3 HBV、DRibbles疫苗治疗HBsAg耐受小鼠。结果可见：与PBS对照组及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组相比,只有接受HBV+DRibbles免疫组淋巴细胞过继转移后,被过继转移小鼠血清中HBsAg水平、HBV DNA拷贝数、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均明显降低,差异具有统计学意义,部分小鼠产生抗HBs抗体；被过继转移组小鼠血清ALT、AST水平无明显变化,肝组织结构基本正常,仅有少量小灶性坏死和炎细胞浸润。结论HBV+ DRibbles疫苗能够高效募集HBV抗原成份；作为HBV抗原的有效载体,能够有效活化DC细胞并交叉递呈HBV抗原；HBV+ DRibbles疫苗免疫能够诱导HBV特异性的细胞免疫应答,并有效预防HBV感染,其中,CD8+T细胞在抑制HBV病毒复制及清除HBV感染的肝细胞中发挥重要作用；HBV+ DRibbles疫苗免疫在HBV感染急性期能够诱导多种HBV抗原及抗原肽特异性的细胞免疫应答、抑制HBV的复制、清除HBV感染的肝细胞,对HBV急性感染具有明显的治疗效果；HBV+ DRibbles疫苗免疫在HBV感染慢性期能够打破免疫耐受、诱导HBV多特异性的细胞免疫应答,抑制HBV的复制、清除HBV感染的肝细胞,对HBV慢性感染具有明显的治疗作用；HBV+ DRibbles疫苗免疫对HBV急性和慢性感染的治疗未造成小鼠肝细胞明显的免疫病理损伤。提示HBV+ DRibbles疫苗在治疗HBV感染方面具有潜在的应用前景。
彭静[9]（2013）在《巨细胞病毒与乙型肝炎病毒之间的异种免疫研究》文中研究表明目的1.建立HBV复制小鼠模型并研究HBV清除的免疫学机制。2.了解MCMV和HBV先后感染/复制的相互影响及其机制。重点研究合并CMV感染对HBV感染转归的影响。材料和方法1.将10ug腺病毒载体构建的HBV表达质粒pAAV/HBV1.2经尾静脉高压水注射入不同来源的6-8周的雄性C57BL/6小鼠（Harla、DEREG、ZTL、Charles River）体内,监测不同时间点血清HBsAg清除情况。2.分别将2ug、5ug、10ugpAAV/HBV1.2经尾静脉高压水注射入三组Harlan小鼠,监测不同时间点血清HBsAg清除情况。3.将10ugpAAV/HBV1.2及其HBV核心区截短的突变体（HBc150、HBc175）以及质粒骨架和HBV序列长度均不同于pAAV/HBV1.2的质粒pSM2分别经尾静脉高压水注射入3组Harlan小鼠体内。监测不同时间点血清HBsAg清除情况。采用细胞内IFNγ染色结合细胞表面染色技术检测Harlan小鼠在分别转染pAAV/HBV1.2和pSM2后不同时间点外周血单个核细胞中HBV特异的T细胞的数量。4.将10ug的pAAV/HBV1.2经尾静脉高压水注射入Harlan小鼠,6周后经腹膜内注射100ul含5×104PFU的MCMV病毒。检测不同时间点血清HBsAg水平。在MCMV感染1周后制备脾脏淋巴细胞悬液用于检测MCMV及HBV特异性T细胞。匀浆肝脏组织,收集上清采用病毒空斑试验检测MCMV的滴度。5.分别对HBV和MCMV免疫的脾脏和肝脏细胞作细胞内因子染色和抗原肽包被的H-2b二聚体和五聚体染色,以检测HBV与MCMV之间是否存在交叉免疫细胞。6.将100ul含1×105PFU MCMV的PBS经腹膜内注射入Harlan小鼠体内,6周后经尾静脉高压水注射10ug pSM2质粒。检测不同时间点血清HBsAg水平。pSM2注射后16天制备脾脏淋巴细胞悬液用于检测MCMV及HBV特异性T细胞及NK细胞、Treg细胞的频率。匀浆肝脏组织,收集上清采用病毒空斑试验检测MCMV的滴度。7.分别采用针对NK细胞、CD8细胞以及INF-γ的单克隆抗体在pSM2转染小鼠前后经腹膜内注射入小鼠体内。监测血清HBsAg水平及HBV特异性T细胞应答强弱的变化。结果1.不同来源的C57BL/6J小鼠在pAAV/HBV1.2转染后1天可检测到血清中HBsAg分泌,第4天到1周达到最高峰,随后逐渐下降,所有Harlan小鼠和DEREG小鼠血清HBsAg分别于第6周和第7周下降至检测限以下。而50%的ZTL小鼠及Charles River小鼠HBsAg血症持续到8周以后。2.三组分别转染了2ug、5ug、10ugpAAV/HBV1.2的Harlan小鼠均在质粒注射后5周内清除了HBsAg血症,清除过程没有显着性差别。3.75%转染pAAV/HBV1.2的Harlan小鼠在质粒注射后4周内清除血清中的HBsAg,而66%转染HBc150及HBc175的小鼠分别在质粒注射后第3周和5周清除血清中的HBsAg o所有转染pSM2的小鼠在注射质粒后2周内HBsAg血症消失。4.pSM2转染后第2周起,在Harlan小鼠PBMC中即可检测到针对HBcAg和HBsAg的特异性免疫应答,其中针对HBcAg的免疫应答显着高于HBsAg。而在pAAV/HBV1.2及其衍生质粒转染的小鼠PBMC中未检测到HBV特异性免疫应答。5.急性HBV清除后的小鼠和未经免疫的小鼠在感染急性MCMV后产生MCMV特异性的T细胞数量以及肝脏中MCMV的病毒含量无显着性差别。急性HBV感染后第7周,血清中HBsAg清除后第2周,在MCMV感染的小鼠而非HBV转染小鼠的脾脏中检测HBV抗原的特异性T细胞应答。采用抗原肽包被的H-2b二聚体和五聚体染色技术在MCMV免疫的脾脏细胞中检测到能同时与HBV抗原肽C1与MCMV抗原肽M57反应的T细胞,在HBV免疫的脾细胞中则未检测到,说明这种交叉免疫具有单向性。6.持续性MCMV感染或未经免疫的Harlan小鼠转染pSM2后,其血清HBsAg水平迅速上升,4天后达到最高峰,以后逐渐下降。持续性MCMV感染的小鼠血清HBsAg清除较缓慢,血清HBsAg水平在转染pSM2后第9、11天均高于未经免疫的小鼠。在9天时有显着性差异。转染pSM2后,两组小鼠未检测到巨噬细胞（F4/80） MHC表达量的显着差异。但是在持续性MCMV感染的小鼠中产IFNy的HBV C1特异性T细胞及NK细胞显着高于未经免疫的小鼠。清除或封闭NK细胞或EFNγ均可增加血清HBsAg水平,同时封闭IFNy还可减低HBV特异性T细胞数量。另外转染pSM2后,持续性MCMV感染小鼠脾脏和肝脏内Treg细胞数量显着高于未经免疫的小鼠。7.持续性MCMV感染的小鼠转染pSM2后,其脾脏中针对MCMV特异性的T细胞数量及肝脏中MCMV的病毒含量较单纯持续性MCMV感染的小鼠无显着性差异。结论1.HBV表达质粒的质粒骨架、HBV序列组成以及小鼠的基因背景决定了HBV在小鼠体内持续时间。其中基因背景的差异普遍存在,来源不同的同品系小鼠清除HBV的能力各不相同。HBV特异性T细胞应答是HBV清除的重要机制,其强弱决定了HBsAg血症持续时间的长短。2.既往的HBV感染对急性MCMV感染的结局和免疫状态没有显着影响。但是持续性MCMV感染对急性HBV复制的免疫状态和结局有显着影响：一方面MCMV记忆细胞能够单向提供对HBV感染的抵抗作用（散发）；另一方面MCMV感染可通过降低的NK细胞和HBV特异性T细胞数量,进而减少IFNy分泌,最终导致HBV的清除减慢。这种现象可能与MCMV感染小鼠中升高的Treg细胞对HBV特异性免疫应答的负性调控有关。继发急性HBV复制对持续性MCMV清除无影响本研究的创新点1.pAAV/HBV1.2经尾静脉高压水注射入C57BL/6J小鼠建立的慢性HBV复制模型已经被广泛认识,但在科学实践中,往往不能成功复制该模型。本研究表明除了小鼠的品系外其来源不同也会影响到HBV持续状态。2.首次利用高压水尾静脉注射小鼠的HBV复制模型和MCMV感染模型来模拟人类HBV和CMV共感染对机体抗病毒免疫功能以及感染结局的影响。本研究的意义既往的研究表明病毒感染结局取决于宿主的遗传背景和病毒致病力,我们的研究表明个体既往的感染病史可对新的病毒感染结局产生影响。本研究建立了MCMV和HBV共感染的小鼠模型,并在此基础上研究了MCMV感染与急性HBV复制之间相互影响及可能的免疫学机制。这些工作拓宽了我们对HBV自然感染状态下（没有一个个体是未经免疫的）机体对HBV的免疫应答和清除机制的认识。另外,我们的研究结果提示在设计疫苗时应当考虑异种免疫对新病原体感染的抵抗作用以及对感染结局的影响。
李娜,易学瑞,袁有成,张欣蕊,孔祥平[10]（2013）在《酒精对C57背景HBV转基因小鼠肝脏损伤的作用》文中认为目的观察长期大量饮酒对C57BL/6J乙型肝炎病毒转基因（hepatitis B virus transgenic,HBV-Tg）小鼠肝脏损伤的作用。方法将30只C57BL/6J HBV-Tg小鼠和30只同背景野生型小鼠分为4组,分别为饮取白酒的HBV-Tg酒精组、野生型酒精组、饮取水的HBV-Tg对照组及野生型对照组。连续观察18个月后,检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine transferase,ALT）、乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）、肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）水平。行肝组织苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色、天狼星红苦味酸染色以观察肝脏形态学改变及胶原沉积情况,同时行肝组织乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B core antigen,HBcAg）、HBsAg免疫组化检测HBcAg、HBsAg的表达,泛素（ubiquitin）免疫组化观察酒精性透明小体（Mallory小体）情况。结果 HBV-Tg酒精组小鼠HBsAg水平在第6个月时达峰值,随后呈下降趋势,第18个月时HBsAg水平显着低于HBV-Tg对照组（P<0.05）,肝组织HBcAg、HBsAg表达显着高于HBV-Tg对照组（P<0.05）。血清ALT、肝组织HYP水平较其余3组明显增高（P<0.05）,肝脏病理损伤最严重,有明显胶原沉积,未观察到肿瘤形成。Ubiquitin免疫组化Mallory小体检出率较野生型酒精组小鼠多。结论HBV表达增加酒精对肝脏损伤的程度,使肝脏更易于向纤维化方向发展。
二、CpGODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CpGODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠（论文提纲范文）
（2）ADAR1通过对COX18和MAVS基因进行RNA编辑影响HBV表达机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 一、前言 |
| 二、研究内容及技术路线 |
| 三、实验方法 |
| 四、研究结果 |
| 五、讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 线粒体抗病毒信号蛋白MAVS介导的抗病毒先天免疫调控机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及发表论文 |
（3）从泛素蛋白酶体途径对TLR信号通路的调控研究补肾方的抗肝损伤机制（论文提纲范文）
| 主要缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分: 补肾方抗肝损伤作用研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂和耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验动物分组和造模 |
| 2.2 采集标本 |
| 2.3 指标检测 |
| 2.3.1 肝功能指标 |
| 2.3.2 肝脏病理组织学 |
| 2.3.3 外周血相关炎症因子 |
| 二、统计学处理 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 对肝功能指标的影响 |
| 3.1.1 谷丙转氨酶(ALT) |
| 3.1.2 谷草转氨酶(AST) |
| 3.1.3 总胆红素(TBIL)和直接胆红素(DBIL) |
| 3.1.4 胆碱酯酶( ChE) |
| 3.2 对肝脏病理组织学的影响 |
| 3.3 对外周血相关炎症因子的影响 |
| 第二部分: 补肾方抗肝损伤的作用机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.1.1 C57BL正常鼠 |
| 1.1.2 Nrdp1基因敲除小鼠 |
| 1.2. 实验药物 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂和耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验动物分组和造模 |
| 2.2 采集标本 |
| 2.3 指标检测 |
| 2.3.1 肝功能指标 |
| 2.3.2 TLR信号通路介导的相关炎症因子的表达 |
| 2.3.3 TLR通路中关键蛋白 |
| 二、统计学处理 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 对肝功能指标的影响 |
| 3.1.1 正常小鼠(Nrdp1未敲除)肝功能 |
| 3.1.2 Nrdp1敲除小鼠肝功能 |
| 3.2 TLR信号通路介导的相关炎症因子表达 |
| 3.3 TLR通路中关键蛋白表达情况 |
| 3.3.1 正常小鼠(Nrdp1未敲除)和Nrdp1敲除小鼠造模前后TLR通路中各关键蛋白的表达 |
| 3.3.2 补肾方对Nrdp1敲除小鼠TLR通路中各关键蛋白表达的影响 |
| 3.3.3 补肾方对正常小鼠(Nrdp1未敲除)TLR通路中各关键蛋白表达的影响 |
| 讨论 |
| 1. 补肾方治疗慢性肝病的渊源 |
| 1.1 补肾方的立法组方 |
| 1.2 补肾方治疗慢性肝病的前期成果 |
| 1.3 补肾方保肝作用的临床研究 |
| 2. 常见肝损伤类型 |
| 2.1 药物性肝损伤 |
| 2.2 免疫性肝损伤 |
| 2.3 酒精性肝损伤 |
| 2.4 病毒性肝炎引起肝损伤 |
| 3. 肝损伤机制相关信号通路 |
| 3.1 Hedgehog信号通路 |
| 3.2 JNK信号通路 |
| 3.3 Nrf-2信号通路 |
| 3.4 cAMP-PKA信号通路 |
| 3.5 NF-κB信号通路 |
| 4. TLRs |
| 4.1 TLR概述 |
| 4.2 TLRs/MyD88/NF-κB信号通路与肝损伤 |
| 5. 泛素蛋白酶体途径 |
| 5.1 泛素蛋白酶体途径组成 |
| 5.2 E3泛素连接酶——Nrdp1 |
| 5.3 泛素连接酶与TLRs信号通路 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1: 文献综述 泛素蛋白酶体系统在肝损伤发生机制中应用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录2: 在校期间已公开发表的论文 |
| 附录3: 参加学术会议情况 |
（4）CS-γ-PGA纳米凝胶在HBV疫苗中的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一部分: 纳米制剂在新型疫苗研究中的应用 |
| 1. 疫苗免疫学机理 |
| 1.1. 抗原特异性免疫应答机制 |
| 1.2. 抗原提呈 |
| 1.3. PRRs |
| 1.4. 细胞因子 |
| 2. 新型疫苗研究中常用纳米制剂 |
| 2.1. 病毒样颗粒 |
| 2.2. 纳米粒 |
| 2.3. 脂质体 |
| 3. 纳米制剂的佐剂效果 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 单剂量正电荷HBsAg纳米凝胶诱导长效免疫防御HBV感染的作用及机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1. 主要实验材料和试剂 |
| 2.2. 仪器设备 |
| 2.3. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. HBsAg纳米凝胶的制备及理化性质考察 |
| 3.2. HBsAg纳米凝胶免疫效果考察 |
| 3.3. HBsAg纳米凝胶制剂诱导抗HBV免疫防御机制 |
| 3.4. 单剂量HBsAg纳米凝胶可诱导对HBV感染的长效防御 |
| 3.5. HBsAg纳米凝胶在慢性HBV感染治疗中的作用 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 负电荷纳米凝胶荷载IL-12表达载体作为HBsAg疫苗佐剂诱导防御HBV感染免疫应答作用的研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1. 主要实验材料和试剂 |
| 2.2. 仪器设备 |
| 2.3. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 荷载IL-12表达载体纳米凝胶(Ng(-)(pIL-12)的制备及理化性质考察 |
| 3.1.1. pIL-12纳米凝胶理化性质考察 |
| 3.1.2. 肌肉注射Ng(-)(pIL-12)后血清中IL-12p70水平增加 |
| 3.2. 高剂量Ng(-)(pIL-12)佐剂对HBsAg疫苗免疫效果的影响 |
| 3.2.1. 高剂量Ng(-)(pIL-12)佐剂对HBsAg疫苗预防HBV感染效果的影响 |
| 3.2.2. 高剂量Ng(-)(pIL-12)佐剂对HBsAg疫苗诱导细胞免疫的影响 |
| 3.2.3. 高剂量Ng(-)(pIL-12)佐剂对HBsAg疫苗诱导体液免疫的影响 |
| 3.3. 低剂量Ng(-)(pIL-12)对HBsAg疫苗的佐剂效果及作用机制 |
| 3.3.1. 低剂量Ng(-)(pIL-12)联合HBsAg疫苗免疫能够有效抵抗HBV感染 |
| 3.3.2. 低剂量Ng(-)(pIL-12)佐剂促进APCs成熟 |
| 3.3.3. 低剂量Ng(-)(pIL-12)佐剂有利于HBsAg疫苗诱导抗原特异性CD4~+T细胞的产生 |
| 3.3.4. 低剂量Ng(-)(pIL-12)佐剂有利于HBsAg疫苗诱导抗原特异性CD8~+T细胞产生 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文创新点及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议及所获荣誉 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（5）新型HBV相关肝细胞癌小鼠模型的构建及其免疫致病机理探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝脏免疫系统的特性 |
| 1.1.1 肝脏的生理学结构 |
| 1.1.2 肝脏的免疫微环境 |
| 1.2 乙型肝炎病毒的研究模型 |
| 1.2.1 乙型肝炎病毒特征及其感染 |
| 1.2.2 乙型肝炎病毒研究的细胞模型 |
| 1.2.3 乙型肝炎病毒研究的动物模型 |
| 1.3 HBV慢性感染及其免疫致病机制 |
| 1.3.1 HBV导致慢性肝炎的发生发展 |
| 1.3.2 HBV导致肝癌的发生发展 |
| 1.4 结语 |
| 第二章 引言 |
| 第三章 材料方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验细胞系 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.3.1 实验动物相关试剂 |
| 3.1.3.2 细胞培养的相关试剂 |
| 3.1.3.3 蛋白质分子生物学相关试剂 |
| 3.1.3.4 分子克隆技术相关试剂 |
| 3.1.3.5 细胞分离相关试剂 |
| 3.1.3.6 流式细胞术检测的相关试剂 |
| 3.1.3.7 组织病理学实验相关试剂 |
| 3.1.3.8 血清学指标检测相关试剂 |
| 3.1.4 实验器材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.1.1 细胞复苏 |
| 3.2.2.2 细胞传代 |
| 3.2.2.3 细胞冻存 |
| 3.2.2 抗体制备纯化 |
| 3.2.3 SDS-PAGE鉴定蛋白 |
| 3.2.4 抽提基因组DNA |
| 3.2.5 鉴定小鼠基因型 |
| 3.2.6 单个核细胞分离 |
| 3.2.7 小鼠肝细胞分离 |
| 3.2.8 小鼠肝脏Kupffer细胞分离 |
| 3.2.9 流式细胞术 |
| 3.2.10 组织病理切片 |
| 3.2.11 组织免疫化学染色 |
| 3.2.12 组织免疫荧光染色 |
| 3.2.13 TUNEL染色 |
| 3.2.14 细胞清除 |
| 3.2.15 细胞转输 |
| 3.2.16 Western Blot |
| 3.2.17 淋巴细胞分选 |
| 3.2.17.1 流式细胞术分选 |
| 3.2.17.2 磁珠分选技术 |
| 3.2.18 单细胞文库制备 |
| 3.2.19 组织RNA抽提和反转录 |
| 3.2.20 定量PCR |
| 3.2.21 转录组生物信息学分析 |
| 3.2.22 单细胞转录组生物信息学分析 |
| 3.2.23 ELISA检测 |
| 3.2.24 血清学指标检测 |
| 3.2.25 放射免疫法检测血清中anti-HBs滴度和HBeAg滴度 |
| 3.2.26 HBV-DNA测定 |
| 3.2.27 疫苗免疫 |
| 3.2.28 统计分析 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 利用肝细胞替代技术成功构建HBV相关肝癌小鼠模型 |
| 4.1.1 利用肝细胞替代技术在受者Fah~(-/-)小鼠中成功重建HBsAg~+肝细胞 |
| 4.1.2 HBsAg~+肝细胞重建小鼠(HBs-HepR)模型的动力学特征 |
| 4.1.3 HBsAg~+肝细胞重建诱导肝脏慢性炎症、纤维化和肝细胞癌的发生 |
| 4.2 HBs-HepR小鼠机体中诱导体液免疫耐受 |
| 4.2.1 HBsAg疫苗免疫HBs-HepR小鼠不能有效产生anti-HBs抗体 |
| 4.2.2 HBs-HepR小鼠脾脏中产生了更多的Treg细胞 |
| 4.2.3 HBs-HepR小鼠肝脏Kupffer细胞表现为免疫抑制的表型 |
| 4.3 抗原特异性CD8~+T细胞在HBV相关肝细胞癌发生发展中发挥关键作用 |
| 4.3.1 HBs-HepR小鼠体内存在抗原特异性的CD8~+T细胞 |
| 4.3.2 HBs-HepR小鼠CD8~+T细胞介导肝细胞凋亡 |
| 4.3.3 CD8~+T细胞清除显着降低HBs-HepR小鼠肝癌的发生率 |
| 4.3.4 HBsAg疫苗致敏的脾脏CD8~+T细胞转输显着逆转HBs-HepR-CD8KO小鼠HCC的发生 |
| 4.4 CD4~+T细胞及NK细胞对HBV相关肝细胞癌发生发展无明显影响 |
| 4.5 HBV相关肝细胞癌诱导T/NK细胞免疫耗竭 |
| 4.5.1 HBs-HepR小鼠在肿瘤形成阶段其免疫细胞在转录水平上表现为耗竭状态 |
| 4.5.2 HBs-HepR小鼠在肿瘤形成阶段其CD8~+T细胞功能耗竭 |
| 4.5.3 HBs-HepR小鼠在肿瘤形成阶段其CD4~+T细胞功能耗竭 |
| 4.5.4 HBs-HepR小鼠在肿瘤形成阶段其NK细胞功能耗竭 |
| 4.6 利用HBV全基因转基因小鼠来源的肝实质细胞建立HBV小鼠模型 |
| 4.6.1 利用肝细胞替代技术在受者Fah~(-/-)小鼠中成功重建HBV~+肝细胞(C57BL6/J背景) |
| 4.6.2 利用肝细胞替代技术在受者Fah~(-/-)小鼠中成功重建HBV~+肝细胞(BALB/c背景) |
| 第五章 讨论和总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
（6）人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1. 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 HBV的起源与进化 |
| 1.2 HBV的病毒结构 |
| 1.3 HBV的基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 HBV的感染机制和生命周期 |
| 2. 乙型肝炎病毒感染及其造成的相关肝脏疾病 |
| 2.1 HBV感染的主要宿主 |
| 2.2 HBV的全球流行状况 |
| 2.3 HBV感染的自然历史过程 |
| 2.4 HBV感染慢性化诱发的相关肝脏疾病 |
| 2.5 HBV感染的诊断和治疗 |
| 3. 乙型肝炎病毒感染细胞模型 |
| 3.1 基于人肝癌细胞系的HBV稳定复制细胞系 |
| 3.2 基于原代人肝细胞和原代树鼩肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.3 基于人肝脏祖细胞系HepaRG的HBV感染细胞模型 |
| 3.4 基于受体过表达的人肝癌细胞系的HBV感染细胞模型 |
| 3.5 基于受体过表达的原代猪肝细胞和原代猴肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.6 基于人干细胞分化获得类肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 4. 乙型肝炎病毒感染动物模型 |
| 4.1 灵长类HBV感染模型 |
| 4.2 树鼩HBV感染模型 |
| 4.3 土拨鼠替代模型 |
| 4.4 北京鸭替代模型 |
| 4.5 HBV转基因小鼠 |
| 4.6 基于病毒基因组转染的HBV复制小鼠模型 |
| 4.7 人类肝脏单嵌合小鼠模型支持HBV感染及抗病毒研究 |
| 4.7.1 免疫缺陷小鼠和细胞移植 |
| 4.7.2 uPA缺陷的免疫缺陷小鼠模型 |
| 4.7.3 HSV-tk/NOG小鼠模型 |
| 4.7.4 Fa~(-/-)Rag2~(-/-)IL2rg~(-/-)(FRG)小鼠模型 |
| 4.7.5 FRGS小鼠模型 |
| 4.8 人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型支持HBV相关疾病研究 |
| 4.8.1 AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型 |
| 4.8.2 人肝和人免疫系统双嵌合的FRGN和uPA-NOG小鼠 |
| 4.8.3 A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠 |
| 4.8.4 HIS-Hep-FRGN小鼠 |
| 4.8.5 HIS-HUHEP-uPA/NRG小鼠 |
| 5. 人骨髓间充质干细胞的生物学特性 |
| 5.1 人骨髓间充质干细胞的发现 |
| 5.2 人骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外培养 |
| 5.3 人骨髓间充质干细胞的多向分化分化潜能和免疫调节功能 |
| 5.4 人骨髓间充质干细胞移植治疗暴发性肝衰竭的分子机制 |
| 6. 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 7. 研究中用到的主要仪器、耗材和试剂 |
| 7.1 主要仪器 |
| 7.2 常规耗材 |
| 7.3 生物化学与细胞生物学常规基础试剂 |
| 7.4 定性和定量检测试剂盒 |
| 7.5 实验用主要溶液及培养基配制 |
| 7.6 常规PCR引物 |
| 7.7 常规抗体和荧光素 |
| 7.8 实验动物和细胞 |
| 8. 常规分子生物学及细胞生物学实验方法 |
| 8.1 ELISA/CLEIA检测 |
| 8.2 Western Blot检测 |
| 8.3 细胞免疫荧光实验 |
| 8.4 免疫组化和病理学染色实验 |
| 8.5 常规流式细胞技术 |
| 8.6 常规哺乳动物细胞培养方法 |
| 9. hBMSC-FRGS小鼠模型构建和鉴定 |
| 9.1 hBMSCs分离、传代培养、冻存、复苏和鉴定 |
| 9.2 FHF-FRGS小鼠的构建及hBMSCs移植手术 |
| 9.3 肝脏灌流分离肝内实质细胞和非实质细胞 |
| 9.4 分离鉴定人源细胞及检测相关标志物 |
| 9.5 鉴定人源肝细胞和鼠源肝细胞是否发生融合 |
| 10. HBV感染相关病毒学和病理学检测 |
| 10.1 不同基因型HBV病毒生产与纯化 |
| 10.2 HBV蛋白与核酸检测方法 |
| 10.3 hBMSC-FRGS小鼠人源免疫反应分析 |
| 10.4 肝硬化诊断方法 |
| 11. 数据处理与统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 hBMSCs移植暴发性肝衰竭FRGS小鼠 |
| 12.1 hBMSCs表型鉴定 |
| 12.2 hBMSCs移植拯救FHF-FRGS小鼠免于死亡 |
| 12.3 hBMSC-FRGS小鼠实现人源肝细胞嵌合 |
| 12.4 hBMSC-FRGS小鼠实现多种人源免疫细胞嵌合 |
| 12.6 嵌合肝脏内的人源肝和鼠源肝细胞未发生融合 |
| 12.7 hBMSC-FRGS小鼠长期安全性评估 |
| 12.8 FHF肝脏微环境是hBMSCs转分化的关键驱动因素 |
| 12.9 第一部分小结 |
| 第二部分 hBMSC-FRGS小鼠支持慢性化HBV感染 |
| 13.1 hBMSC-FRGS小鼠支持多种基因型HBV感染 |
| 13.2 hBMSC-FRGS小鼠支持C基因型HBV感染慢性化 |
| 13.3 第二部分小结 |
| 第三部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠免疫病理生理学研究 |
| 14.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠肝人源内免疫细胞变化 |
| 14.2 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内人源细胞因子变化 |
| 14.3 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠发生重症肝炎 |
| 14.4 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠产生特异性针对HBV抗原的T细胞 |
| 14.5 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠血清HBV特异性抗体水平变化 |
| 14.6 第三部分小结 |
| 第四部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠诱发人源肝硬化 |
| 15.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清学肝硬化指标变化 |
| 15.2 HBV感染肝hBMSC-FRGS小鼠组织学肝硬化指标变化 |
| 15.3 肝硬化区域种属特异性鉴定 |
| 15.4 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 16. HBV细胞模型和动物模型的发展历程 |
| 17. 基于间充质干细胞的人类肝脏再生和免疫系统重建 |
| 18. HBV感染慢性化和诱导肝脏疾病发生的关键机制 |
| 19. 新型HBV抗病毒治疗策略与关肝脏疾病的防治措施 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（7）肿瘤相关抗原GPC3特异性细胞免疫诱导进行原发性肝癌干预的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写与注解 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 基金资助情况 |
| 发表文章 |
| 申请专利 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）HepG2.2.15细胞来源的自噬小体疫苗（HBV+DRibbles）防治HBV感染及其免疫机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语注释表 |
| 前言 |
| 研究背景 |
| 研究目的及内容 |
| 研究的创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 综述 慢性乙型肝炎治疗性疫苗的研究进展 |
| 一、蛋白类疫苗 |
| 二、肽类疫苗 |
| 三、DC疫苗 |
| 四、DNA疫苗 |
| 五、腺病毒疫苗 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 第一部分 HepG2.2.15细胞来源的自噬小体疫苗(HBV~+DRibbles)的制备与鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HBV~+DRibbles疫苗诱导HBV特异性免疫应答及其预防HBV感染的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBV~+DRibbles疫苗治疗HBV急性感染的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 HBV~+DRibbles疫苗治疗HBV慢性感染的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（9）巨细胞病毒与乙型肝炎病毒之间的异种免疫研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写名词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 HBV复制小鼠模型建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 既往HBV感染与急性MCMV之间的相互影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 持续性MCMV感染与急性HBV复制之间的相互影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）酒精对C57背景HBV转基因小鼠肝脏损伤的作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料及试剂 |
| 1.2 C57BL/6J遗传背景HBV-Tg小鼠的培育 |
| 1.3 实验动物分组及处理 |
| 1.4 血清HBsAg、ALT检测 |
| 1.5 肝组织病理检查 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 体质量变化 |
| 2.2 肝脏外观及肝体质量比 |
| 2.3 血清HBsAg水平 |
| 2.4 血清ALT水平 |
| 2.5 肝组织HYP水平 |
| 2.6 肝组织HE染色 |
| 2.7 肝组织天狼星红苦味酸染色 |
| 2.8 肝组织抗HBcAg、HBsAg免疫组化 |
| 2.9 肝组织抗ubiquitin免疫组化 |
| 3 讨论 |
四、CpGODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠（论文参考文献）
- [1]原发性肝癌常见动物模型的研究进展[J]. 夏猛,孙玉浩,王萌,冷静. 临床肝胆病杂志, 2021(08)
- [2]ADAR1通过对COX18和MAVS基因进行RNA编辑影响HBV表达机制的研究[D]. 李涛. 北京协和医学院, 2020(05)
- [3]从泛素蛋白酶体途径对TLR信号通路的调控研究补肾方的抗肝损伤机制[D]. 赵彬彬. 上海中医药大学, 2019(03)
- [4]CS-γ-PGA纳米凝胶在HBV疫苗中的应用研究[D]. 王海刚. 山东大学, 2019(09)
- [5]新型HBV相关肝细胞癌小鼠模型的构建及其免疫致病机理探究[D]. 郝晓磊. 中国科学技术大学, 2019(02)
- [6]人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究[D]. 袁伦志. 厦门大学, 2019(08)
- [7]肿瘤相关抗原GPC3特异性细胞免疫诱导进行原发性肝癌干预的研究[D]. 陈坤. 北京协和医学院, 2017(11)
- [8]HepG2.2.15细胞来源的自噬小体疫苗（HBV+DRibbles）防治HBV感染及其免疫机制的实验研究[D]. 薛萌. 东南大学, 2015(10)
- [9]巨细胞病毒与乙型肝炎病毒之间的异种免疫研究[D]. 彭静. 华中科技大学, 2013(02)
- [10]酒精对C57背景HBV转基因小鼠肝脏损伤的作用[J]. 李娜,易学瑞,袁有成,张欣蕊,孔祥平. 华南国防医学杂志, 2013(04)