一、猪卵巢卵母细胞的收集和体外成熟培养（论文文献综述）
曹丽华[1]（2021）在《ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达与功能研究》文中指出闭锁小带蛋白（ZO）-1和ZO-2（ZO-1/2）,又称为紧密连接蛋白（TJP）-1和TJP2,属于膜相关鸟苷酸激酶（MAGUKs）家族,参与上皮细胞极性维持、基因转录、细胞增殖和肿瘤细胞转移等生物学过程。小鼠的研究发现,下调ZO-1/2表达对早期胚胎发育不利,表明两者参与胚胎发育调控,但ZO-1/2在家畜的研究较少,特别是在家畜卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达和功能尚不清楚。为此,本研究以猪为研究对象,研究ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达模式,并通过正负调控其表达的方式,探讨它们在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的作用及分子机制。研究结果可丰富对ZO-1/2生物学功能的认识,同时为阐明家畜卵泡发育和卵母细胞成熟的分子机理提供依据。1、ZO-1/2在不同大小猪卵泡中的表达水平及对颗粒细胞增殖的影响实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot（WB）分析ZO-1/2在猪胎儿各组织的表达结果显示,ZO-1/2在猪胰腺、大脑、心、肝、肺、肾、膀胱、小肠、卵巢和睾丸组织均有表达,两者在睾丸组织中的表达均显着高于卵巢组织（P<0.05）。不同直径猪卵泡中ZO-1/2的表达分析结果显示,它们在不同大小卵泡中均有表达,且RNA和蛋白水平表达趋势一致。ZO-1在小卵泡（<2 mm）颗粒细胞中的表达显着高于大卵泡（5～8 mm）（P<0.05）,ZO-2在小卵泡颗粒细胞中的表达显着高于健康中卵泡（3～5 mm）和大卵泡（P<0.05）。ZO-1/2在闭锁卵泡颗粒细胞中的表达均显着高于健康的中卵泡和大卵泡（P<0.05）,与小卵泡无显着差异（P>0.05）。ZO-1/2在卵丘卵母细胞复合体（COCs）中的表达均显着高于同等大小卵泡中颗粒细胞的表达（P<0.05）,它们在小卵泡COCs中的表达显着高于中卵泡和大卵泡,在闭锁卵泡COCs中的表达显着高于健康卵泡（P<0.05）。构建猪ZO-1/2的慢病毒表达载体,探讨过表达ZO-1/2对猪颗粒细胞增殖以及细胞周期和凋亡相关基因表达的影响。结果发现,过表达ZO-1或ZO-2均显着抑制颗粒细胞增殖（P<0.05）。上调ZO-1表达颗粒细胞的Occludin表达增加（P<0.05）,Cyclin A2和Cyclin B的表达降低（P<0.05）,Cyclin D1表达没有显着变化（P>0.05）。上调ZO-2表达颗粒细胞中Cyclin A2和Cyclin D1的表达显着降低（P<0.05）,Cyclin B和Occludin的表达变化不大（P>0.05）。过表达ZO-1/2不影响颗粒细胞中Bcl-2和Bax的表达（P>0.05）,而Caspase3和Caspase9表达显着上调（P<0.05）。2、ZO-1/2在猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育过程中的功能研究qRT-PCR和WB方法分析ZO-1/2在猪卵母细胞体外成熟（IVM）和早期胚胎发育过程中的表达模式,结果显示,ZO-1/2在卵丘细胞、卵母细胞和早期胚胎中均有表达,ZO-1α+仅在卵丘细胞、桑葚胚和囊胚表达。ZO-1/2在生发泡（GV）期卵母细胞中的表达极显着高于卵丘细胞（P<0.01）,它们在GV期COCs中RNA表达水平最高,在体外成熟18 h时蛋白表达水平最高。筛选有效干扰ZO-1/2的sh RNA片段,构建慢病毒表达载体,研究下调ZO-1/2表达对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。QRT-PCR结果显示,成熟液中添加ZO-1/2 sh RNA慢病毒显着降低了MII期卵母细胞、卵丘细胞以及囊胚中内源性ZO-1/2的表达（P<0.05）。与未处理组相比,ZO-1sh RNA1、ZO-2sh RNA2慢病毒单独感染或二者联合感染均不影响卵丘细胞扩展、卵母细胞核成熟以及孤雌胚胎卵裂率（P>0.05）;ZO-2sh RNA2感染显着抑制了卵母细胞皮质颗粒迁移（P<0.05）,ZO-1sh RNA1没有显着影响（P>0.05）。下调ZO-1表达降低了孤雌胚胎的囊胚率（P<0.05）,下调ZO-2表达未产生显着影响（P>0.05）;下调ZO-1/2表达均降低了囊胚总细胞数（P<0.05）。下调ZO-1/2表达抑制了成熟后卵丘细胞中Cx43、Cx45、PTX3和PTGS2,卵母细胞中Cx45、BMP15、ZP3和C-kit的表达,以及囊胚中Nanog的表达（P<0.05）,不影响卵丘细胞中HAS2和囊胚中Oct4的表达（P>0.05）。3、猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中ZO-1/2的调控机制研究首先,通过qRT-PCR或WB方法分析了PMSG/h CG、MG132对ZO-1/2表达的影响。结果显示,成熟培养液中所含的PMSG/h CG不影响ZO-1/2的表达（P>0.05）,添加5μM MG132显着上调体外成熟22 h时ZO-1/2的RNA和蛋白表达水平（P<0.05）。其次,探讨了雌二醇（E2）对猪卵母细胞体外成熟、ZO-1/2及缝隙连接的影响。结果显示,低浓度E2不影响猪卵母细胞核成熟（P>0.05）,当浓度大于100μM时卵母细胞核成熟受到显着抑制（P<0.05）。钙黄绿素红染色结果显示,E2处理促进了体外成熟24 h时的细胞间缝隙连接通讯（GJIC）。QRT-PCR结果显示,E2处理显着上调了体外成熟24 h时COCs中Cx43、Cx45、ZO-1和ZO-2的表达（P<0.05）,但不影响它们在卵母细胞中的表达（P>0.05）。最后,研究了E2对体外培养猪颗粒细胞增殖及ZO-1/2表达的影响。结果显示,当E2处理浓度大于50μM时,颗粒细胞增殖速度显着下降（P<0.05）,而雌激素受体拮抗剂ICI182780处理没有显着影响（P>0.05）。在含10%FBS的培养条件下,E2浓度为10μM时能显着下调颗粒细胞中ZO-1/2的表达,浓度为100μM时显着上调ZO-1/2的表达（P<0.05）;100μM ICI182780和100μM E2联合处理不影响颗粒细胞中ZO-1/2的表达（P>0.05）。以上结果表明:（1）ZO-1和ZO-2在猪卵泡中的表达均呈现随直径增大而降低的趋势,且闭锁卵泡中ZO-1/2表达高于健康卵泡;（2）过表达ZO-1/2抑制颗粒细胞增殖,下调细胞周期相关基因并上调凋亡相关基因的表达;（3）ZO-1和ZO-2在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达模式相似,ZO-1/2表达会降低猪卵母细胞成熟和早期胚胎发育效率;（4）ZO-1/2的表达在猪卵母细胞成熟过程中受泛素-蛋白酶体通路和雌激素的调控。
王玲[2]（2021）在《GGT1不同剪接体鉴定及其对哺乳动物卵泡发育和排卵的功能研究》文中进行了进一步梳理卵泡发育和卵子发生是动物成功繁殖的关键,也是养猪业中产仔数的决定因素。卵泡的发育和卵母细胞的成熟受到卵巢内外多种因素共同调控作用。选择性剪接是最重要的转录后调控之一,单个基因通过不同的剪接方式产生大量的mRNA和蛋白异构体,从而增加了基因表达的复杂性,促进了蛋白质的多样性。选择性剪接在动物卵泡发育和排卵等生理过程中发挥重要的调控作用。本研究筛选并验证了在梅山猪和大白猪中差异表达的基因γ-谷氨酰转移酶1（γ-glutamyltransferase 1,GGT1）的两个剪接体:全长剪接体（GGT1-01）和11号外显子发生外显子跳跃事件的剪接体（GGT1-02）,并在猪卵巢颗粒细胞中进行功能研究;并成功构建GGT1基因（对应猪GGT1-02转录本）敲除小鼠,研究其在卵泡发育和排卵过程中的分子功能。研究内容与结果如下:1、GGT1基因不同剪接体调控猪卵巢颗粒细胞的生长和前列腺素合成的研究（1）利用MISO软件筛选出差异表达的GGT1基因不同剪接体（|ΔPSI|≥10%）。通过对GGT1基因不同剪接体进行验证,发现GGT1-02剪接体在梅山猪卵巢组织中高表达。GGT1-02剪接体促进猪卵巢颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡,而GGT1-01剪接体不参与颗粒细胞的增殖和凋亡的调控作用。（2）GGT1-02与跨膜转运蛋白1（transmembrane and coiled-coil domains 1,TMCO1）存在互作,上调细胞内钙离子浓度,激活细胞质磷脂酶A2（cytoplasmic phospholipase A2,cPLA2）,促进花生四烯酸（arachidonic acid,AA）的合成,并通过AA-PTGS2-PGE2通路促进前列腺素的合成。GGT1-01不参与前列腺素合成的生物学过程。（3）qRT-PCR和Western blotting试验结果表明富含丝氨酸和精氨酸剪接因子1（serine and arginine rich splicing factor 1,SRSF1）通过其第二个RNA识别结构域（RNA recognition motif,RRM）和富含丝氨酸/精氨酸结构域（arginine-and serine-rich domain,RS）结构域调控GGT1基因选择性剪接,进而上调GGT1-02剪接体的表达。构建不同剪接因子突变片段的GGT1-minigene真核表达载体,将其与SRSF1超表达载体共转至猪胚胎肾细胞,发现在GGT1外显子11上存在异质核核糖核蛋白H1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein family H1,hn RNPH1）的结合位点对SRSF1调控GGT1选择性剪接十分重要,通过Co-IP证明了SRSF1与hn RNPH1相互作用共同调控GGT1的选择性剪接。（4）SRSF1可以促进卵巢颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡。在猪卵巢颗粒细胞中,通过ELISA等试验,表明SRSF1可以促进猪卵巢颗粒细胞中前列腺素的合成。通过质粒共转试验表明SRSF1介导GGT1基因的选择性剪接,从而调控卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡及促进颗粒细胞中前列腺素合成。2、利用基因敲除小鼠模型研究Ggt1基因在卵泡发育和排卵过程中功能（1）通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Ggt1基因敲除小鼠模型。相较于野生型小鼠,Ggt1-/-小鼠在出生10 d后出现生长缓慢、卵巢重量显着下降（P<0.01）、不孕并且无法成功排卵。通过ELISA试验检测血清中激素水平,与野生型小鼠相比,Ggt1-/-小鼠血清中睾酮水平以及LH/FSH水平显着上升（P<0.05）、前列腺素水平显着下降（P<0.01）、雌激素水平不存在差异。通过3周龄、5周龄和8周龄的野生型小鼠和Ggt1-/-小鼠卵巢组织切片的H&E染色发现:3周龄Ggt1-/-小鼠卵巢切片中的初级卵泡、次级卵泡以及有腔卵泡数目并无显着差异,但观察到显着增加的闭锁卵泡数目（P<0.01）。5周龄Ggt1-/-小鼠卵巢切片中的初级卵泡、次级卵泡并无显着差异,但有腔卵泡数目显着降低,闭锁卵泡数目显着增加（P<0.05）。在8周龄Ggt1-/-小鼠卵巢切片中发现显着增加的次级卵泡（P<0.05）,而未见排卵前有腔卵泡。以上结果表明,Ggt1-/-小鼠卵泡发育受损、排卵障碍、激素水平紊乱,出现类似于人多囊卵巢综合征的临床表型。（2）采用EdU、TUNEL和Western blotting实验方法检测3周龄和8周龄的野生型和Ggt1-/-小鼠卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡水平。试验结果表明:3周龄Ggt1-/-小鼠和野生型小鼠颗粒细胞的增殖与凋亡未见显着差异;但在8周龄小鼠卵巢切片中,增殖的颗粒细胞显着减少（P<0.01）以及凋亡颗粒细胞显着增加（P<0.05）。Ggt1-/-小鼠卵巢组织蛋白中PCNA和BCL-2蛋白表达量显着降低（P<0.05）,BAX蛋白表达量显着升高（P<0.05）。（3）卵巢切片透射电镜试验结果表明:3周龄Ggt1-/-小鼠的卵巢透射电镜中未见线粒体结构和数目的改变,但在8周龄Ggt1-/-小鼠卵巢电镜中发现显着增加的结构紊乱的线粒体（P<0.05）。此外对卵母细胞线粒体功能检测,发现8周龄Ggt1-/-小鼠卵母细胞ROS水平显着增加（P<0.01）,线粒体膜电位、mt DNA拷贝数以及ATP水平显着减低（P<0.01）。此外,通过对野生型小鼠和Ggt1-/-小鼠GV期卵母细胞的进行体外培养,我们发现Ggt1-/-小鼠GV期卵母细胞的GVBD率以及第一极体排除率显着降低（P<0.01）。（4）通过在三周龄断奶Ggt1-/-小鼠饮用水中添加10 mg/mL的N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）,在一定程上恢复Ggt1-/-小鼠生长,恢复颗粒细胞生长,恢复卵泡的发育和GV期卵母细胞的体外成熟。综上所述,Ggt1是卵泡发育、排卵和雌性生育所必需的。Ggt1缺失导致线粒体功能障碍和ROS积累,导致雌性小鼠类似PCOS表型;NAC能缓解Ggt1缺乏引起的雌性小鼠线粒体功能障碍和卵母细胞发育缺陷;GGT1与TMCO1相互作用,通过颗粒细胞AA-PTGS2-PGE2通路激活cPLA2,加速PGE2合成,促进卵泡发育。本研究表明,NAC可以恢复Ggt1-/-雌性小鼠的PCOS样表型,并扩展了对人类患者PCOS潜在治疗方案的理解。
曾毅仁[3]（2020）在《三（2-羧基乙基）膦盐酸盐处理对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育能力的影响研究》文中研究指明卵母细胞体外成熟（IVM）是决定体外胚胎发育的关键过程。体外高氧培养环境造成的氧化应激是影响卵母细胞体外成熟质量的重要因素。活性氧的增加会使脂质、蛋白质、DNA受到损伤,最终可能导致卵母细胞质量和后续胚胎发育能力降低。本实验探究了抗氧化剂三（2-羧基乙基）膦盐酸盐（TCEP-HCL）对猪卵母细胞体外成熟和受精胚胎体外发育能力的影响。我们在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加了三个浓度TCEP-HCL（50,100和200μM）进行处理。结果发现与未添加组相比,100μM TCEP-HCL处理显着增加了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）、受精卵分裂率（P<0.05）、囊胚形成率（P<0.05）、囊胚总细胞数（P<0.05）;200μM TCEP-HCL对卵母细胞的成熟以及后续胚胎的发育没有影响（P>0.05）。TCEP-HCL处理影响了卵母细胞的受精情况,和未处理组相比,100μM TCEP-HCL处理显着降低了猪卵母细胞的多精入卵率（P<0.05）,并显着提高了单精入卵率（P<0.05）。为了探究TCEP-HCL对猪卵母细胞体外受精和胚胎发育能力改善的潜在机制,我们检测了MⅡ期卵母细胞和体外受精囊胚中的抗氧化和细胞凋亡相关指标。结果发现,TCEP-HCL处理显着降低了卵母细胞内活性氧（ROS）水平（P<0.05）,100μM TCEP-HCL处理提高了卵母细胞内氧化应激相关基因SOD2的表达。同时,和其他实验组相比,100μM TCEP-HCL处理显着增加了卵母细胞内谷胱甘肽（GSH）的含量（P<0.05）;显着提高了卵母细胞中线粒体的含量（P<0.05）;显着降低了IVM后卵母细胞凋亡率（P<0.05）,显着增加细胞凋亡抑制基因BCL2的表达（P<0.05）。TCEP-HCL处理降低了囊胚细胞凋亡,特别是在100μM和200μM TCEP-HCL处理组中表现最为明显（P<0.05）。以上研究结果表明,适宜的TCEP-HCL处理降低了猪卵母细胞体外成熟过程中的氧化应激水平,提高了体外受精胚胎的质量和发育能力。
潘柳竹[4]（2020）在《哺乳动物卵母细胞染色质构型分类与发育能力的关系研究》文中认为哺乳动物卵母细胞的生发泡（germinal vesicle,GV）染色质最初是不凝集的,随着卵母细胞生长,染色质会凝集成不同的构型。生发泡染色质构型与卵母细胞发育能力相关。然而,过去报导的卵母细胞生发泡染色质构型分类标准不统一,并且不能很好地与卵母细胞发育能力联系起来。因此,亟需建立卵母细胞染色质构型分类标准,进而明确其与发育能力的关系。此外,玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）可进入食物链引起健康问题,因此研究其对卵母细胞的毒性作用对人类和动物的健康生殖都具有重要意义。体内和体外ZEN暴露都损伤卵母细胞的发育能力,但其作用机理并不清楚。本研究目的是对卵母细胞染色质构型进行分类,探究ZEN对染色质构型的影响。从GV期染色质构型角度探索其影响卵母细胞质量的潜在机制,深入研究卵母细胞染色质构型与发育能力的关系。首先,本研究利用改进的能够清楚地观察到卵母细胞核仁和染色质的Hoechst33342染色方法,将猪和小鼠GV期卵母细胞按照染色质围绕核仁凝集程度和在核质中的分布情况分为8种构型。然后比较大小卵泡、健康与闭锁、卵巢运输与保存和不同培养基的染色质构型分布确定各构型的发育能力。最后,通过小鼠ZEN体内暴露模型,利用免疫荧光染色、一步法RT-q PCR等方法,探究ZEN对染色质构型和基因转录的影响,进一步了解ZEN损伤卵母细胞的机制。主要的研究结果如下:1、猪和小鼠卵母细胞染色质构型分类为8种类型:不包围核仁型（NSN）、包围核仁型（SN）、部分NSN（p NSN）和部分SN（p SN）、提前凝集的NSN（c NSN）、p NSN（cp NSN）、p SN（cp SN）、早期终变期（ED）。2、来源于1-2 mm健康卵泡的NSN构型猪卵母细胞在199培养基中经历p NSN、p SN、cp SN到ED的连续转变过程;来源于3-6mm健康卵泡卵母细胞在199培养基中培养时,SN构型卵母细胞染色质发生重新去凝集,形成RDC构型,用Roscovitine抑制GVBD后增加RDC构型的卵母细胞比例。3、在不利条件下,例如卵泡闭锁、卵巢长时间保存或者在成分简单的MEM培养基中成熟培养,卵母细胞染色质会发生提前凝集,形成c NSN、cp NSN和cp SN构型。4、所有的NSN和p NSN以及部分p SN和RDC构型卵母细胞进行活跃的基因转录,c NSN、cp NSN和cp SN构型卵母细胞无一表现出转录活动。5、体外成熟和胚胎培养表明,SN和p SN构型卵母细胞比NSN和p NSN构型卵母细胞发育能力强;cp SN型卵母细胞发育能力强于c NSN和cp NSN构型卵母细胞;只有RDC构型的卵母细胞能发育成囊胚。6、猪COCs体外成熟期间添加ZEN导致猪卵母细胞NSN构型提前凝集为c NSN构型,卵母细胞的成熟率降低。体内ZEN暴露也降低小鼠卵母细胞孤雌激活胚胎4-细胞和囊胚比例,表明ZEN通过影响卵母细胞染色质构型影响发育能力。7、小鼠体内ZEN暴露破坏MI期卵母细胞纺锤体组装,引起MII期卵母细胞染色体非整倍性的比例增加,ZEN通过破坏纺锤体组装影响卵母细胞染色体分离。8、小鼠体内ZEN暴露升高卵母细胞的H2O2水平,同时降低卵母细胞线粒体膜电位和GSH/GSSG比值。9、小鼠体内ZEN暴露引起卵母细胞生长过程中NSN、p NSN和p SN构型卵母细胞染色质提前凝集,形成c NSN、cp NSN和cp SN构型。10、体内ZEN暴露降低卵母细胞整体转录活性,进而导致GV期卵母细胞内与发育能力、纺锤体组装、抗氧化和抗凋亡相关的基因Mater、Oct4、Plk1、Aurka、Cat、Nrf2及Bcl2的m RNA表达显着下调,与氧化还原和促凋亡基因Gpx1、Gsr、Sod2和Bax的m RNA表达显着上调。总之,我们的研究结果表明,比起以往所报道的分类方法,我们新的染色质构型分类方法更为紧密地将卵母细胞染色质构型与发育能力联系起来。ZEN暴露通过影响染色质构型进而影响基因表达来降低卵母细胞的发育能力。
焦亚飞[5]（2020）在《PI3K/Akt信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响》文中进行了进一步梳理卵母细胞是动物胚胎工程技术研发的基础,其成熟质量直接影响胚胎工程技术的效率。猪卵母细胞的体外成熟质量显着低于体内成熟,需要进一步完善猪卵母细胞的体外成熟技术体系。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）与卵泡的募集、卵泡颗粒细胞的增殖、黄体的形成以及卵母细胞的成熟有关,但有关猪卵母细胞成熟的研究较少。为此,本研究初步探究了PI3K/Akt信号通路与猪卵母细胞成熟的关系,以期通过调节PI3K/Akt信号通路提高猪卵母细胞的体外成熟质量。1.探讨了EGF激活PI3K/Akt信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,成熟培养基中添加10 ng/m L的EGF可以显着提高卵丘细胞的扩展（P<0.05）,显着提高卵母细胞体外成熟率（P<0.05）;孤雌胚胎的2-细胞率、4-细胞率和囊胚率也显着提高（P<0.05）。通过RT-q PCR分析,PI3K/Akt信号通路的激活使GDF9、Akt、CDC2、Cyclin B1和MOS表达水平发生显着上调（P<0.05）,P34表达水平发生极显着上调（P<0.01）,BMP15表达也发生上调但与对照组相比差异不显着（P>0.05）;Western blot检测发现,10 ng/m L EGF可以显着提高p-Akt Thr308磷酸化水平（P<0.05）。2.研究了PI3K/Akt信号通路激活剂PS48对猪卵母细胞体外成熟和卵丘细胞增殖的影响。通过Hoechst33342对不同浓度培养的卵母细胞进行染色后,发现10μM PS48可以显着促进卵母细胞向MII期发育（P<0.05）,通过RT-q PCR分析,结果显示,GDF9和BMP15的相对表达量显着降低（P<0.05）,MOS和Cyclin B1的表达量极显着升高（P<0.01）,Akt和m TOR的表达量显着升高（P<0.05）,而CDC2的表达量没有显着差异（P>0.05）,Western blot检测显示,10μM的PS48可以显着提高p-Akt Thr308磷酸化水平和Akt蛋白水平（P<0.05）。对卵丘细胞培养和RT-PCR分析发现,10μM PS48可以显着促进卵丘细胞的增殖,提高了卵丘细胞线粒体膜电位（P<0.05）,凋亡相关基因BCL2、Caspase3极显着下调（P<0.01）,BAX发生显着下调（P<0.05）,增殖基因PCNA极显着上调（P<0.01）,周期相关基因P27、CDK4差异不显着（P>0.05）。3.探讨了PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,50μM LY294002对猪卵丘细胞扩展的抑制作用显着（P<0.05）,并能显着抑制卵母细胞的成熟率和2-细胞率（P<0.05）,通过RT-q PCR检测发现,GDF9、BMP15、Akt、CDC2、Cyclin B1和P34基因表达发生了极显着下调（P<0.01）,Western blot结果显示,Akt和p-Akt Thr308均在卵母细胞中表达,而50μM的LY294002对猪卵母细胞中Akt和p-Akt Thr308均有抑制作用,Akt蛋白表达显着降低（P<0.05）,p-Akt Thr308磷酸化水平极显着低于对照组（P<0.01）。综上结果表明,在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加10 ng/ml EGF可以显着提高p-Akt Thr308磷酸化水平,并进一步提高卵母细胞成熟率和孤雌激活胚胎发育的能力,成熟培养基中添加10μM的PS48同样可以提高卵母细胞的成熟率。相反,在成熟培养基中添加50μM的PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002,可以抑制卵母细胞的成熟,以及减少了孤雌囊胚细胞数。
陈雪[6]（2020）在《维生素A对猪卵母细胞成熟及胚胎早期发育的影响》文中认为目前猪的卵母细胞在体外成熟的效率较低、质量较差,导致后期胚胎体外生产的发育效率低下,严重影响了克隆技术在生物医学模型和动物繁殖等领域中的应用。卵母细胞体外成熟是体细胞核移植、体外受精等技术的主要环节,制约着后期胚胎发育的生产效率,对胚胎发育的影响至关重要。本实验主要以猪卵母细胞和孤雌激活（PA）、体细胞核移植（SCNT）、体外受精（IVF）囊胚为研究对象,旨在探究体外培养体系中,维生素A（VtiaminA,VA）对卵母细胞体外成熟及其胚胎早期发育的影响。首先,本实验对猪卵母细胞培养基中所添加的VA浓度进行了优化,发现20μg/ml的VA能显着提高猪卵母细胞的体外成熟率（75%±2.13%vs 52%±3.26%）（***P<0.01,差异极显着）。除此之外,还发现VA添加组中MⅡ期卵母细胞内RAR基因和GSH基因的转录水平均显着高于对照组。成熟后卵母细胞的免疫荧光染色结果进一步证实,VA添加组MⅡ期细胞内的ROS和GSH的抗氧化水平显着高于对照组。基于上述结果,本实验接着用VA对PA、SCNT、IVF早期胚胎的卵裂率、囊胚率的影响进行了深入研究。结果发现,与对照组相比,孤雌胚胎VA添加组的 2 细胞卵裂率（89.33%±2.89%vs 81.33%±2.53%）,4 细胞卵裂率（81%±3.04%vs 70.33%±2.2%）、8 细胞卵裂（50%±2.13%vs 41.67%±2.18%）及胚胎的囊胚率（30%±3.16%vs 23.67%±2.29%）明显高于对照组（*P<0.05,差异显着）;SCNT胚胎VA添加组的2细胞卵裂率（60.33%±2.34%vs 50.67%±3.23%）,4细胞卵裂率（38.67%±3.54%vs 29.67%±2.27%）、8 细胞卵裂率（35.67%±2.73%vs 27.67%±3.18%）及胚胎的囊胚率（17.33%±3.29%vs 9.67%±3.16%）也明显高于对照组（*P<0.05,差异显着）,以及IVF胚胎VA添加组的2细胞卵裂率（79.67%±2.34%vs 58.67%±3.23%）,4 细胞卵裂率（59%±3.14%vs 49.67%±2.47%）、8 细胞卵裂率（39.33%±2.33%vs 29.67%±3.58%）及胚胎的囊胚率（21%±2.49%vs 17%±2.66%）均显着高于对照组（*P<0.05,差异显着）。最后,本实验探究了 VA对PA、SCNT、IVF囊胚的多能性、囊胚数及凋亡的影响。免疫荧光染色分析结果发现,相比较与对照组,VA添加组囊胚中,多能性基因Oct4、Cdx2、Sox2等的表达量明显上升,囊胚细胞数也有显着提高,且VA添加组的囊胚凋亡情况显着低于对照组。综上所述,本实验优化了猪卵母细胞和胚胎在体外培养体系中VA的培养浓度,并证明了优化后的VA能显着提高猪卵母细胞的体外成熟率,同时能显着提高胚胎的卵裂率、囊胚率。除此之外,发现VA添加组能增强并提高猪囊胚的细胞数和多能性,总体提高了猪卵母细胞体外成熟和胚胎发育效率。本研究有利于克隆技术在生物医学模型和动物繁殖等领域中更好的应用。
李田田[7]（2020）在《猪IVF胚胎早期卵裂时间对其发育潜能影响的初步研究》文中研究指明早期卵裂（early cleavage,EC）即受精卵发生第一次分裂形成为2-cell胚胎。EC也是优质胚胎早期筛选的重要依据之一,而早期胚胎质量也影响到人类辅助生殖妊娠结局、克隆胚胎移植妊娠效率、体外受精胚胎移植的效率,在人类辅助生殖和动物体外胚胎生产中具有重要的研究和应用价值。本课题旨在探讨猪进行体外受精（in vitro fertilization,IVF）后胚胎早期卵裂时间与其发育潜能之间的关系。具体研究内容如下:1.猪IVF胚胎初次卵裂时间观测:对猪IVF胚胎初次卵裂的不同时间点划分为10个时间段,即18 h、18-20 h、20-22 h、22-24 h、24-26 h、26-28h、28-30 h、30-32 h、32-42 h和42-48 h后期发育情况进行检测,结果发现:猪IVF胚胎从受精以后18 h开始有卵裂出现,到48 h为止基本完成了2细胞的分裂活动。在20-32 h之间,产生卵裂的胚胎数量占卵裂胚胎总数60%-70%,32 h之后的2个时间段内,产生卵裂的胚胎数量占卵裂胚胎总数不到30%,猪IVF胚胎初次卵裂胚胎呈现一种正态分布的总体趋势。初次卵裂时间与发育成囊胚的几率密切相关,在20-22 h卵裂的胚胎,其囊胚率达到24.25%,然而超过42 h才发生初次卵裂的胚胎,大多数会在发育过程中凋亡,难以发育到囊胚期,由此可初步判断早期进行初次卵裂的胚胎所拥有的发育潜能更高。2.卵裂时间对候选基因相对表达水平的影响:本试验分为2组,即猪IVF早期卵裂胚胎组（≤24 h）和猪IVF晚期卵裂胚胎组（30-36 h）使用QRT-PCR检测方法。分别收集早、晚期卵裂胚胎的2-cell胚胎通过QRT-PCR检测方法进行候选基因差异表达分析。结果显示:猪IVF早期卵裂胚胎组（≤24 h）Oct4、Sox2和Klf4基因相对表达量均显着高于猪IVF晚期卵裂胚胎组（30-36 h）（P<0.05）,其中Oct4、Sox2在猪IVF早期卵裂胚胎组（≤24 h）和猪IVF晚期卵裂胚胎组（30-36 h）之间差异极显着（P<0.01）。进一步检测凋亡相关基因发现猪IVF早期卵裂胚胎组（≤24 h）的Caspase-3基因表达量,极显着低于猪IVF晚期卵裂胚胎组（30-36 h）（P<0.01）,Bcl-xl基因表达量显着低于猪IVF晚期卵裂胚胎组（30-36 h）（P<0.05）。3.猪IVF早期卵裂胚胎组和晚期卵裂胚胎组差异表达基因谱构建。对早期卵裂组（n=2）和晚期卵裂组（n=2）分别进行单细胞转录组PE150测序,每个试验获得6 G测序数据,测序原始数据质量良好（Q30≥90.76%）。经Cuffdiff进行分析发现早、晚期卵裂胚胎4个样本的转录组总库中,涵盖有123种差异基因（log2≥1,P≤0.05）,包括上调35种基因和下调88种基因。通过GO功能富集分析得出,在高尔基体蛋白糖基化的调控、糖蛋白合成代谢过程调控、mRNA和RNA转运、核酸的运输等表达基因富集显着。GO功能富集到的相关基因进一步注释分析发现14种可能参与胚胎早期发育调控的基因,分别为TMEM59、ITGB1、QKI、SAR1A、HEXB、EFNA1、MRPS26、SLC16A7、MTMR8、YBX3、GLCE、ANKRA2、LCMT2、LDHB。其中TMEM59属于I型跨膜蛋白,参与高尔基体调控和蛋白质的合成代谢,具有促凋亡效果。ITGB1参与蛋白质的调控和胶原蛋白分解代谢过程,在细胞方面主要作用于细胞膜,与细胞增殖和凋亡有关。本试验结果表明,初次卵裂时间较早的猪IVF胚胎发育潜能显着高于晚期卵裂,QRT-PCR和单细胞转录组测序揭示部分基因在早期分裂的胚胎具有较高相对表达水平,这些基因在高尔基体蛋白糖基化的调控、糖蛋白合成代谢过程调控、mRNA和RNA转运、核酸的运输等富集显着。本研究为建立基于早期卵裂时间筛选发育潜能较高的猪IVF胚胎的技术奠定了基础亦对指导其他动物胚胎筛选和提高妊娠结局具有一定的参考价值,在畜牧业生产中可大大提高母猪的繁殖力和产子率。
郝宇晨[8]（2020）在《CXCL12、VEGFA和WNT5A优化猪卵母细胞体外成熟体系及机制研究》文中认为基因编辑技术和动物克隆技术的结合使基因操作在猪的分子育种和动物模型构建上变得简易高效,但该技术体系需要大量的卵母细胞来生产克隆胚胎。目前在大动物上主要是从屠宰场获得废弃卵巢组织,再从中获取未成熟的卵母细胞进行体外成熟,从而获得成熟的卵母细胞来供克隆胚胎的构建。在猪上,通过体外成熟（In Vitro Maturation,IVM）获得的卵母细胞以及随后的发育能力与体内环境下产生的相比仍存在成熟率低、胚胎发育率低、囊胚内细胞团（Inner Cell Mass,ICM）细胞数少、动物出生效率低等问题。在体内,母体调节因子会赋予卵母细胞以及胚胎较强的发育能力,而当前的体外成熟培养系统很难提供充足而有效的母体调节因子,从而降低了卵母细胞和早期胚胎的质量。通过转录组分析确定CXCL12、VEGFA和WNT5A（称为CVW）为猪卵母细胞成熟过程中为猪卵母细胞成熟过程中的重要母体细胞因子,因此本研究通过在猪卵母细胞成熟体系中单独或联合添加CVW母体分泌因子,并从卵母细胞成熟和早期胚胎发育两个方面探究CVW三因子的对二者的生物学作用。主要研究成果如下:（1）CVW添加到猪卵母细胞体外成熟液后可以有效提高卵母细胞的成熟质量,即核成熟率从对照组的57.2%提高到75.9%且P<0.001,同时CVW能够降低卵母细胞的早期凋亡率。（2）CVW添加到猪卵母细胞体外成熟液后对照组卵丘扩展直径大于600μm的比例为53.0%而CVW组比例为64.2%;MII卵母细胞对照组TZPs数量为56.0±15.5而CVW组为45.0±18.5且P<0.05;体外受精后对照组多精受精比例59.5%而CVW组比例43.0%。因此,CVW扩大了卵周隙的间隙并促进卵丘细胞的扩展从而导致透明带中更完整的跨区投射回缩（The Transzonal Projections,TZPs）即从而降低所成熟的卵母细胞在体外受精（In vitro fertilization,IVF）过程中发生多精受精的比例。（3）若在猪卵母细胞体外成熟液中添加CVW相应的受体抑制剂,其不但抑制CVW受体介导的信号通路而且严重影响卵母细胞的减数分裂恢复和卵丘细胞的扩展。（4）CVW添加到猪卵母细胞体外成熟液对成熟的改善是通过在IVM过程中提前激活MAPK途径并在IVM周期结束前调节WNT途径实现的。（5）通过在猪卵母细胞体外成熟液中添加CVW而获得的成熟卵母细胞,无论是孤雌激活还是体外受精后的囊胚率与对照组相比均会提高10%以上。CVW还会增加囊胚的总细胞数和ICM细胞数并降低囊胚中凋亡细胞数的比例。以上结果表明母体细胞因子CVW可提高体外成熟卵母细胞的质量和后续的发育潜力。这些发现表明CVW优化了猪卵母细胞IVM体系,从而为猪克隆等技术提供大量优质的卵母细胞,为最终提高猪的克隆效率以及生殖医学研究提供支持。
陈华丽[9]（2020）在《Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制》文中研究指明哺乳动物超过99%的卵子在发育过程中都会经历闭锁性退化而不排卵,在促性腺激素的作用下,其中一些可以达到排卵前阶段,为了促进濒危物种以及基因优良畜禽体外培养卵子更好的应用,卵子发生和卵泡发育的机制尚需进一步研究。颗粒细胞分泌的激素和生长因子对卵泡发育起重要作用,同时卵母细胞分泌各种生长因子也可以调节颗粒细胞的增殖和分化。在卵泡液中含有多种不同水平的类固醇激素,比如雌激素、孕酮和雄激素,可以通过作用于颗粒细胞生长以及卵泡液的形成来影响卵巢的卵泡发育。近年来很多的研究表明,Wnt信号可以调节小鼠和人类的性腺发育和性别分化,并且可以调节激素的合成和分泌,对哺乳动物卵泡形成和发育以及卵巢功能的维持具有重要作用,可以参与调控卵泡闭锁等生理过程。Wnt5a和Wnt11属于非经典Wnt蛋白,它们在颗粒细胞中表达并且在整个卵泡发育过程中发挥特异的调控作用。当颗粒细胞Wnt5a失去活性的时候可以导致小鼠卵泡闭锁增加和排卵率降低。然而Wnt非典型通路对猪卵泡发育的作用尚未见系统报道,本文探究Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡发育过程中凋亡和激素分泌的影响。本试验通过抽吸法取得直径为2-5mm的卵泡中的卵泡液,并且收集颗粒细胞和卵母细胞,在体外培养液中添加一定剂量的Wnt/Ca2+通路中蛋白抑制剂或激活剂,包括Wnt蛋白抑制剂IWP-2、磷脂酶C（PLC）蛋白抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS以及PKCβ蛋白抑制剂Enzastaurin。通过显微镜观察卵母细胞成熟率;通过CCK8试验分别观察IWP-2、U73122、m-3M3FBS或Enzastaurin对颗粒细胞活力的影响。由荧光Ca2+指示剂Fluo3-AM监测颗粒细胞内钙离子含量,Ca2+指示剂Fura-2AM测定卵母细胞内钙离子含量。采用实时荧光定量（q RT-PCR）法检测通路相关基因以及激素分泌、细胞凋亡调控相关基因转录水平的表达;Annexin V-FITC法检测PLC抑制剂和激活剂对颗粒细胞的凋亡的影响。酶联免疫法（ELISA法）检测猪颗粒细胞雌二醇和孕酮的水平。Western Blot法检测凋亡调控若干蛋白、PLC四个亚基蛋白及三种钙离子敏感蛋白（PKCβ、CAMKⅡα、Caln A）的相对表达量。得到如下主要研究结果:1. 与对照组相比,0.05μM或5μM的IWP-2对猪颗粒细胞活力没有影响,0.1μM、0.5μM和2.5μM的IWP-2增加了猪颗粒细胞活力（P<0.05）。这表明Wnt配体在一定程度上抑制颗粒细胞活力。PLC抑制剂U73122的浓度不超过0.5μM时颗粒细胞的活力没有变化,浓度增加时细胞活力在4 h、24 h和48 h降低（P<0.05）,而PLC激活剂m-3M3FBS的添加使12 h之前的颗粒细胞活力随着浓度的增加呈现先升高再降低的趋势,m-3M3FBS浓度为0.5μM时活力最高（P<0.05）。这表明,PLC蛋白参与猪颗粒细胞的活力,并且一定程度上促进颗粒细胞活力。与对照组相比,0.25μM和2μM的Enzastaurin可以降低猪颗粒细胞的活力（P<0.05）。2.0.1-5μM的Wnt抑制剂IWP-2可以对卵母细胞成熟的抑制作用具有剂量依赖性,并且0.5μM的IWP-2抑制卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。0.5μM的PLC抑制剂U73122提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）,降低了卵裂率（P<0.001）和囊胚率（P<0.01）;0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS降低了卵母细胞成熟率（P<0.05）,提高了卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。这说明Wnt配体在猪卵母细胞的成熟过程中可能具有促进作用,PLC蛋白可以抑制卵母细胞的成熟。3.0.5μM的IWP-2可以下调颗粒细胞（P<0.01）和卵母细胞（P<0.05）中的Ca2+的浓度。0.5μM的IWP-2处理猪颗粒细胞24 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCG1（P<0.01）和PLCZ1（P<0.001）的m RNA丰度;IWP-2处理猪卵母细胞44 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.001）和PLCZ1（P<0.001）基因的表达,同时降低了PLCD3（P<0.05）蛋白的表达。抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS对PLCB1 m RNA的最佳作用时间是4 h,最佳处理浓度是0.5μM。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h降低了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,同时降低了PLCB1（p=0.001）和PLCG1（P<0.05）的相对蛋白丰度以及钙离子的浓度（P<0.001）。0.5μM的m-3M3FBS处理颗粒细胞4 h显着增加了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,并升高了钙离子浓度（P<0.01）。与对照组相比,0.5μM的U73122处理猪卵母细胞44h后,PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.01）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度下降,钙离子浓度变化不大;用0.5μM m-3M3FBS处理猪卵母细胞44小时后,PLCB1（P<0.01）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.05）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度增加,PLCB1蛋白的丰度明显增加（P<0.05）,钙离子浓度增加（P<0.05）。IWP-2与U73122共同作用降低了颗粒细胞（P<0.001）和卵母细胞（P<0.05）中的钙离子水平,而IWP-2与m-3M3FBS共同作用则对颗粒细胞和卵母细胞的钙离子水平没有影响。结果表明,Wnt配体与PLC蛋白可以协同调节卵泡内钙离子水平的变化,能够增加胞质中Ca2+的增加。4. 在颗粒细胞中,抑制剂U73122降低了钙离子敏感蛋白PKCβ（P<0.05）、CAMKIIα（P<0.05）和Caln A（P<0.01）的表达丰度,激活剂m-3M3FBS升高了CAMKIIα蛋白（P<0.001）的表达量。在卵母细胞中,PLC蛋白对PKCβ和CAMKIIα蛋白具有正调控功能（P<0.05）,但是不影响Caln A的表达。在颗粒细胞中,抑制剂U73122可以下调CDC42（P<0.01）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.01）的m RNA表达水平,同时对CTNNB有少许上调作用（P>0.05）;激活剂m-3M3FBS可以上调CDC42（P<0.05）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.05）的m RNA表达水平,同时降低CTNNB（P<0.05）的表达。在卵母细胞中,PLC对下游基因具有上调作用,但是并不影响CTNNB的m RNA表达水平（P>0.05）。结果表明,PLC蛋白可以激活猪颗粒细胞和卵母细胞的钙离子敏感蛋白和下游基因,并且在颗粒细胞中可以抑制CTNNB的表达。5.0.5μM的IWP-2上调了调控猪颗粒细胞凋亡的BAK（P<0.001）、BAX（P<0.01）、CASP8（P<0.05）和TP53（P<0.05）基因的m RNA水平,同时Bak、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达增加（P<0.05）。0.5μM的IWP-2处理猪卵母细胞44 h之后,BAX（P<0.01）、CASP3（P<0.05）和TP53（P<0.01）基因的表达显着升高,同时抗凋亡基因BCL6（P<0.05）基因的表达降低;Bax（P<0.01）和Cleaved caspase3（P<0.05）蛋白的表达显着增加,Bcl-6（P<0.01）蛋白的表达降低。PLC活性变化可以抑制颗粒细胞的凋亡调控基因,并且在不同的时间对凋亡率的影响有所不同。0.5μM的PLC抑制剂U73122可以上调BAK（P<0.01）、BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.01）的m RNA表达水平。0.5μM的U73122作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率（P<0.05）和晚期凋亡率（P<0.05）达到最高。PLC激活剂m-3M3FBS可以上调抗凋亡基因BCL2（P<0.01）的m RNA水平,并且下调BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.05）的m RNA表达;并降低Bax蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达。0.5μM的m-3M3FBS作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率最高（P<0.05）,作用8 h时晚期凋亡率达到最高（P<0.05）。用0.5μM U73122培养猪卵母细胞44小时,与对照组相比,、、CASP3（P=0.001）、和的相对m RNA丰度增加,而的相对m RNA水平降低;、Cleaved和蛋白的表达上调。使用0.5μM m-3M3FBS培养猪卵母细胞44 h,与对照组相比,、、CASP3（p）、和TP53（p=0.001）的相对m RNA丰度降低,而BCL6的相对m RNA水平而升高（图4-6 D）;Bcl-6的蛋白表达丰度增加（P<0.05）,且P53的蛋白表达丰度降低。0.5μM的IWP-2与0.5μM的U73122于体外共同处理猪的颗粒细胞,与对照组相比,上调了BAK（P<0.01）、BAX（P<0.001）、CASP3（P<0.01）、CASP8（P<0.001）和TP53（P<0.05）的m RNA表达量,下调了BCL2（P<0.05）的m RNA表达水平。在猪颗粒细胞培养液中同时添加0.5μM的IWP-2和0.5μM的m-3M3FBS,与对照组相比,BAK（P<0.001）和CASP8（P<0.001）的m RNA表达水平降低。与对照组相比,2μM的Enzastaurin增加了BAK（P<0.001）、BAX（P<0.001）和CASP3（P<0.01）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.001）基因的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用增加了BAK（P<0.001）和BAX（P<0.05）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.01）基因的表达。2μM的Enzastaurin增加了Bax蛋白（P<0.05）的表达,降低了Bcl-2蛋白（P<0.01）的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用降低了Bcl-2蛋白（P<0.001）的表达。结果表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以协同抑制猪颗粒细胞和卵母细胞的凋亡过程。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同促进猪颗粒细胞的凋亡。6.0.5μM IWP-2可以促进猪颗粒细胞中雌二醇相关基因CYP17A1（P<0.01）、CYP19A1（P<0.01）、ER1（P<0.001）和ER2（P<0.01）的表达上调。0.5μM PLC抑制剂U73122可以上调猪颗粒细胞CYP11A1基因（P<0.05）,0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS对激素调控的作用很小。0.5μM U73122处理颗粒细胞2 h、8 h、12 h、24 h、48 h后雌二醇分泌下降（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2h后雌二醇分泌下降（P<0.05）。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h增加了孕酮的分泌（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h和8 h后孕酮水平增加（P<0.05）。0.5μM的U73122处理猪颗粒细胞后,除了8 h（P>0.05）之外,各时间点雌二醇与孕酮的比例均下降（P<0.05）。使用0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h降低了雌二醇与孕酮的比例（P<0.05）。IWP-2和U73122共同作用提高了参与调节E2和P4的基因的m RNA表达水平,IWP-2与m-3M3FBS共同作用降低了CYP11A1的m RNA表达水平（P<0.01）,提高了CYP17A1（P<0.05）、CYP19A1（P<0.01）和ER1（P<0.05）的表达水平。与对照组相比,2μM Enzastaurin以及0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用均增加了猪颗粒细胞中CYP11A1基因（P<0.01）的表达和降低了CYP19A1（P<0.001）基因的表达。0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用比2μM Enzastaurin单独作用更明显地降低了猪颗粒细胞中CYP17A1基因的表达。研究表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以共同调控猪颗粒细胞和卵母细胞的雌二醇（E2）和孕酮（P4）的激素水平。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同调控三种激素相关基因CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1。综上所述,Wnt/Ca2+信号通路中Wnt蛋白和PLC蛋白可发挥协同作用在猪的卵泡发育过程中具有抑制细胞凋亡和调节激素分泌的功能;Wnt/Ca2+信号关键蛋白PLC可以调控钙离子敏感蛋白和下游基因的表达。
徐高骁[10]（2019）在《基于卵巢全转录组学和代谢组学筛选影响猪产仔数性状的候选基因、非编码RNA及miR-183-circTCP1轴的功能验证》文中研究表明产仔数是猪繁殖性状一个重要的经济性状,是反应猪场生产水平和经济效益的重要指标。卵巢是母猪重要的生殖器官,在每个发情周期都经历一系列的生物学过程,卵巢中包含编码基因和非编码基因的复杂转录网络紧密调控着母猪的产仔。但这些影响母猪产仔数的分子调控机理仍不明晰。本课题选择猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）和猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）是抗原阴性的高产仔数（LLS,larger litter size）和低产仔数（SLS,smaller litter size）大白长白二元杂交母猪为研究对象,利用卵巢全转录组测序（RNA Sequencing,RNA-seq）以及卵巢代谢组学分析策略,筛选与母猪高产性状相关的关键候选基因、microRNA、circRNA、lncRNA、代谢物、GO条目和KEGG通路,建立初步的影响母猪产仔数分子调控网络体系。然后,通过用RT-qPCR、EdU染色实验、CCK-8实验、Western Blot、流式细胞检测和双荧光素酶检测等方法对该分子调控网络体系中重要节点miR-183-circTCP1轴进行体外功能验证,深入研究影响母猪产仔数的分子调控机制。主要研究结果如下:1、基于卵巢全转录组学筛选影响母猪产仔数性状关键候选基因本研究对LLS组和SLS组大白长白二元杂母猪卵巢进行去核糖体RNA的高通量测序。每个样本得到约1亿clean reads,与猪参考基因组匹配率最高为96.3%,最低为94.1%。在LLS组较SLS组卵巢组织中鉴定出2708个差异表达基因,其中上调的差异表达基因有1110个,下调的差异表达基因有1598个。通过GO和KEGG分析得到15个STAR、HSD17B2、HSD17B12、BMP6、BMP4、INHBA、BMP2、GDF7、TGFBR1、TGFB3、BMP7、AKR1C1、CYP21A2、GDF5和HSD17B8可能影响猪产仔数的候选基因,富集在Hippo信号通路、TGF-beta信号通路、类固醇激素合成和卵巢甾类激素合成4条对产仔数有影响的通路。其中在LLS组较SLS组的卵巢组织中,上调的差异表达基因有STAR、HSD17B2、HSD17B12、INHBA、TGFBR1、AKR1C1,下调的差异表达基因有BMP6、BMP4、BMP2、BMP7、GDF5、GDF7、TGFB3、CYP21A2、HSD17B8。2、基于卵巢全转录组学筛选影响猪产仔数的非编码RNA利用RNA-seq,在LLS组较SLS组的卵巢组织中筛选出差异表达的miRNA、lncRNA和circRNA分别为33、302和548个,并挑选了在LLS组和SLS组间表达量差异显着,且与卵巢发育、卵巢类固醇激素合成相关非编码RNA进行了RT-qPCR的验证。构建了lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络结构,找到影响猪产仔数的关键候选miRNA 2个（miR-183、miR-1343）、关键候选lncRNA 4个（LOC110259814、LOCLOC106504714、LOC106505099和LOC110257180）、关键候选circRNA7个（circ-TCP1、circ-PAN3、circ-DDX19B、circ-LOC106505137、circ-ANKRD12、circ-SNX25和circ-SLA-5）。3、基于卵巢代谢组学筛选影响猪产仔数性状的关键代谢物及其候选基因主要利用代谢组学对LLS和SLS两组猪的卵巢组进行了代谢产物的分析,最终得到55个差异代谢产物,并主要富集在18条差异的通路上。在这18条差异通路上,多条通路共有的关键代谢物有:苯胺、组胺和1-哌啶,影响这三个代谢物的关键候选基因主要有6个（ANXA8、LOC100524773、LOC110258110、DDO、,SMIM1和AZGP1）。其中组胺富集在FcεRI信号通路上。这些重要的节点可能是影响猪产仔性能的潜在因素。4、miR-183在高产性母猪卵巢中的功能和miR-183-circTCP1轴的鉴定（1）miR-183能促进猪卵巢颗粒细胞（GCs）的增殖,对GCs凋亡没有显着的影响。（2）miR-183在细胞S期,抑制了颗粒细胞雌二醇（E2）的合成而促进了孕酮（P4）的合成,3β-HSD是P4合成过程中的关键功能基因,Cyp19a1是E2合成过程中的关键功能基因。（3）miR-183在LLS组水平显着上调,较SLS组产生优势卵泡颗粒细胞,促进卵泡的发育,从而提高猪产仔数。（4）circ-TCP1可能作为ceRNA竞争性吸附miR-183,在母猪高产性相关的生物过程中发挥关键调控作用。
二、猪卵巢卵母细胞的收集和体外成熟培养（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪卵巢卵母细胞的收集和体外成熟培养（论文提纲范文）
（1）ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(中英文对照表) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 卵泡发育和卵母细胞成熟 |
| 1.1 卵泡发育过程 |
| 1.2 颗粒细胞在卵泡发育和卵子发生过程中的作用 |
| 1.3 雌激素对卵泡发育的影响 |
| 1.4 卵母细胞体外成熟 |
| 1.5 雌激素对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2 ZO-1/2基因研究进展 |
| 2.1 紧密连接 |
| 2.2 ZOs基因的发现 |
| 2.3 ZOs的结构 |
| 2.4 ZOs的分布 |
| 2.5 ZOs的功能及其作用机制 |
| 2.6 ZOs的调控因素 |
| 研究目的和意义 |
| 第二章 ZO-1/2在猪卵泡发育过程中的表达模式及作用初步研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 ZO-1/2基因在猪组织中的表达情况 |
| 2.2 ZO-1/2在猪卵泡发育过程中的表达模式 |
| 2.3 猪ZO-1/2ORF的扩增与序列分析 |
| 2.4 pGC-ZsGreen1-ZO-1/2慢病毒表达载体验证 |
| 2.5 过表达ZO-1/2对颗粒细胞增殖的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 ZO-1/2在猪组织及卵泡发育过程中的表达规律 |
| 3.2 过表达ZO-1/2对猪颗粒细胞增殖的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 ZO-1/2在猪卵母细胞成熟过程中的表达规律及功能研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 ZO-1/2在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达模式 |
| 2.2 ZO-1/2在猪早期胚胎发育过程中的表达模式 |
| 2.3 ZO-1/2sh RNA表达载体构建及筛选 |
| 2.4 下调ZO-1/2表达对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 ZO-1/2基因在猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育过程的表达模式 |
| 3.2 下调ZO-1/2基因表达对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 4 小结 |
| 第四章 ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的调控机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪卵母细胞体外成熟过程中ZO-1/2表达的调控因素 |
| 2.2 E_2对猪卵母细胞体外成熟和ZO-1/2表达的影响 |
| 2.3 ZO-1/2及Cx43 基因间的相互作用分析 |
| 2.4 E_2对颗粒细胞增殖的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 体外成熟过程中ZO-1/2表达的调控方式 |
| 3.2 E_2对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3 E_2对颗粒细胞中ZO-1/2表达的影响 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
（2）GGT1不同剪接体鉴定及其对哺乳动物卵泡发育和排卵的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 研究问题的由来 |
| 2 哺乳动物卵泡发育过程及调控 |
| 2.1 卵泡发育 |
| 2.2 卵母细胞的成熟 |
| 2.3 颗粒细胞在卵泡发育过程中的功能 |
| 2.4 卵泡发育过程中的激素调控作用 |
| 3 氧化应激与卵泡发育 |
| 3.1 卵巢中活性氧的来源 |
| 3.2 氧化应激对卵泡发育的损伤 |
| 4 选择性剪接概述 |
| 4.1 剪接因子 |
| 4.2 卵泡发育过程中的选择性剪接 |
| 4.3 选择性剪接的调控 |
| 5 GGT1基因概述 |
| 5.1 GGT1基因简介 |
| 5.2 GGT1基因的生物学功能 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二章 GGT1基因不同剪接体调控猪卵巢颗粒细胞功能和前列腺素合成的研究 |
| 1 试验材料与分析网站 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 动物组织和细胞 |
| 1.1.2 菌株和抗体 |
| 1.1.3 主要仪器和设备 |
| 1.1.4 主要试剂与试剂盒 |
| 1.1.5 常用试剂及配制 |
| 1.2 生物信息学网站及分析软件 |
| 1.2.1 生物信息学网站 |
| 1.2.2 分析软件 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 猪GGT1基因不同剪接体的功能研究 |
| 2.1.1 猪GGT1基因不同剪接体的验证 |
| 2.1.2 猪GGT1基因不同剪接体表达载体的构建 |
| 2.1.3 猪GGT1不同剪接体干扰片段的合成 |
| 2.1.4 猪卵巢细胞的分离 |
| 2.1.5 细胞的培养和转染 |
| 2.1.6 细胞总RNA的提取 |
| 2.1.7 cDNA的制备 |
| 2.1.8 实时荧光定量PCR检测基因mRNA的表达水平 |
| 2.1.9 蛋白质提取及浓度测定 |
| 2.1.10 Western blotting |
| 2.1.11 MTT |
| 2.1.12 EdU染色 |
| 2.1.13 流式细胞仪分析细胞凋亡 |
| 2.1.14 免疫共沉淀 |
| 2.1.15 免疫荧光 |
| 2.1.16 ELISA分析 |
| 2.1.17 抑制剂处理细胞 |
| 2.2 调控猪GGT1基因选择性剪接的关键剪接因子及功能研究 |
| 2.2.1 关键剪接因子真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 剪接因子SRSF1干扰片段的合成 |
| 2.2.3 剪接因子SRSF1不同结构域缺失的表达载体的构建 |
| 2.2.4 GGT1小基因片段真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 RNA免疫沉淀 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪GGT1基因不同剪接体的鉴定 |
| 3.2 GGT1基因不同剪接体对猪卵巢颗粒细胞功能的影响 |
| 3.2.1 GGT1基因不同剪接体在猪卵巢颗粒细胞增殖过程中的功能研究 |
| 3.2.2 GGT1基因不同剪接体在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中的功能研究 |
| 3.2.3 GGT1基因不同剪接体对猪卵巢颗粒细胞线粒体功能的研究 |
| 3.2.4 GGT1基因不同剪接体对猪卵巢颗粒细胞激素合成的影响 |
| 3.2.5 GGT1基因不同剪接体对猪卵泡发育相关基因的调控作用 |
| 3.3 GGT1基因不同剪接体调控猪卵巢颗粒细胞的前列腺素合成 |
| 3.3.1 猪GGT1基因不同剪切体的γ-谷氨酰转移酶活性检测 |
| 3.3.2 猪GGT1基因不同剪切体调控花生四烯酸的合成 |
| 3.3.3 猪GGT1基因不同剪切体调控花生四烯酸的合成的限速酶表达 |
| 3.3.4 猪GGT1基因不同剪切体通过调控钙离子浓度激活cPLA2活性 |
| 3.3.5 猪GGT1-02与TMCO1 互作调控颗粒细胞中钙离子浓度 |
| 3.4 剪接因子SRSF1调控猪GGT1基因选择性剪接 |
| 3.4.1 调控猪GGT1基因选择性剪接的主要剪接因子的鉴定 |
| 3.4.2 剪接因子SRSF1参与猪GGT1基因选择性剪接调控 |
| 3.4.3 剪接因子SRSF1通过RRM2和RS结构域调控猪GGT1基因选择性剪接 |
| 3.4.4 剪接因子SRSF1与hnRNPH1互作调控猪GGT1基因选择性剪接 |
| 3.5 SRSF1调节GGT1基因选择性剪接从而调控猪卵巢颗粒细胞功能的研究 |
| 3.5.1 SRSF1调控猪卵巢颗粒细胞增殖 |
| 3.5.2 SRSF1调控猪卵巢颗粒细胞凋亡 |
| 3.5.3 SRSF1调控猪卵巢颗粒细胞前列腺素合成 |
| 3.5.4 SRSF1调节GGT1基因选择性剪接从而调控猪颗粒细胞细胞的增殖 |
| 3.5.5 SRSF1调节GGT1基因选择性剪接从而调控猪卵巢颗粒细胞的凋亡 |
| 3.5.6 SRSF1调节GGT1基因选择性剪接从而调控猪卵巢颗粒细胞的前列腺素合成 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GGT1不同剪接体在猪卵巢颗粒细胞中的功能研究 |
| 4.2 猪GGT1-02与TMCO1互作通过AA-PGTS2-PGE2通路调控前列腺素合成 |
| 4.3 SRSF1调控猪GGT1不同剪接体的选择性剪接 |
| 第三章 利用基因敲除小鼠模型研究Ggt1基因在卵泡发育和排卵过程中功能 |
| 1 试验材料与分析网站 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 抗体 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂与试剂盒 |
| 1.1.5 常用试剂及配制 |
| 1.2 生物信息学软件及分析网站 |
| 1.2.1 生物信息学软件 |
| 1.2.1 分析网站 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 Ggt1基因敲除小鼠的构建 |
| 2.1.1 相关引物设计与合成 |
| 2.1.2 CRISPR/Cas9 sgRNA的体外转录 |
| 2.1.3 显微注射 |
| 2.1.4 胚胎移植 |
| 2.1.5 突变小鼠的鉴定 |
| 2.2 Ggt1基因敲除小鼠表型研究 |
| 2.2.1 乙酰半胱氨酸添加 |
| 2.2.2 血清主要生殖激素检测 |
| 2.2.3 组织的固定及包埋 |
| 2.2.4 苏木精-伊红(H&E)染色 |
| 2.2.5 组织免疫荧光 |
| 2.2.6 EdU染色 |
| 2.2.7 TUNEL染色 |
| 2.2.8 超数排卵和交配 |
| 2.2.9 裸卵的收集与培养 |
| 2.2.10 卵母细胞活性氧的检测 |
| 2.2.11 卵母细胞线粒体膜电位检测 |
| 2.2.12 卵母细胞ATP检测 |
| 2.2.13 qRT-PCR相关引物的合成 |
| 2.2.14 统计学处理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Ggt1基因敲除小鼠的构建 |
| 3.2 Ggt1~(-/-)小鼠具有与人多囊卵巢综合征相似的临床表型 |
| 3.2.1 Ggt1基因敲除小鼠不孕 |
| 3.2.2 Ggt1~(-/-)小鼠生长缓慢 |
| 3.2.3 Ggt1~(-/-)小鼠卵泡发育停滞 |
| 3.2.4 Ggt1~(-/-)小鼠激素水平异常 |
| 3.3 Ggt1~(-/-)小鼠卵巢颗粒细胞生长受阻 |
| 3.4 Ggt1~(-/-)小鼠卵巢线粒体相关功能受损 |
| 3.4.1 8周龄Ggt1~(-/-)小鼠卵巢线粒体结构破坏 |
| 3.4.2 8周龄Ggt1~(-/-)小鼠卵巢线粒体功能受损 |
| 3.5 Ggt1~(-/-)小鼠卵母细胞体外发育受损 |
| 3.6 NAC挽救Ggt1~(-/-)小鼠生殖缺陷 |
| 3.6.1 NAC促进Ggt1~(-/-)小鼠生长 |
| 3.6.2 NAC促进Ggt1~(-/-)小鼠卵巢颗粒细胞生长 |
| 3.6.3 NAC促进Ggt1~(-/-)小鼠GV期卵母细胞体外成熟 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Ggt1缺失小鼠具有与人多囊卵巢综合征患者相似的临床症状 |
| 4.2 Ggt1~(-/-)小鼠的线粒体功能障碍导致卵泡生长停滞 |
| 4.3 NAC的添加可以挽救Ggt1~(-/-)小鼠生殖缺陷 |
| 全文结论 |
| 创新与不足 |
| 下一步工作计划 |
| 已发表的论文 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）三（2-羧基乙基）膦盐酸盐处理对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育能力的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪卵母细胞体外成熟的研究进展 |
| 2 猪卵母细胞体外成熟的影响因素 |
| 2.1 物理因素 |
| 2.1.1 猪卵巢的来源 |
| 2.1.2 卵巢离体后的时间 |
| 2.1.3 卵巢离体后的温度 |
| 2.1.4 卵巢的质量及卵泡的大小 |
| 2.1.5 猪卵母细胞体外培养体系 |
| 2.2 化学因素 |
| 2.2.1 激素 |
| 2.2.2 抑制或促进卵母细胞成熟的因子 |
| 2.2.3 血清 |
| 2.2.4 卵泡液(PFF) |
| 2.2.5 卵丘细胞 |
| 2.2.6 Ca~(2+)及钙调素 |
| 2.2.7 巯基物质 |
| 3 氧化应激与胚胎发育的关系 |
| 3.1 活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和氧化应激的产生 |
| 3.2 在卵子发生过程中的ROS和氧化还原反应 |
| 3.3 在胚胎发育过程中的ROS和氧化还原反应 |
| 3.4 卵母细胞体外成熟中的氧化应激 |
| 4 抗氧化系统 |
| 4.1 抗氧化剂的分类 |
| 4.2 抗氧化剂与体外成熟 |
| 5 巯基类还原剂 |
| 5.1 β-巯基乙醇(β-ME) |
| 5.2 二硫苏糖醇(DTT) |
| 5.3 三(2-羧基乙基)膦盐酸盐 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二章 TCEP-HCL对卵母细胞成熟、体外受精和胚胎发育能力的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 卵巢 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.1.4 实验耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 卵母细胞的收集和体外培养 |
| 1.2.2 体外受精和胚胎培养 |
| 1.2.3 核成熟和体外受精状态的评估 |
| 1.2.4 胚胎发育的评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 TCEP-HCL对猪卵母细胞核成熟及体外受精的影响 |
| 2.2 TCEP-HCL对猪卵母细胞体外受精胚胎发育能力的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 TCEP-HCL对卵母细胞质量的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 卵巢 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.1.4 实验耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 卵母细胞的收集和体外培养 |
| 1.2.2 卵母细胞成熟后细胞内GSH和 ROS含量的检测 |
| 1.2.3 RT-qPCR |
| 1.2.4 卵母细胞体外成熟后线粒体含量的测定 |
| 1.2.5 卵母细胞凋亡的测定 |
| 1.2.6 囊胚凋亡细胞的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 TCEP-HCL对猪卵母细胞GSH和 ROS水平的影响 |
| 2.2 TCEP-HCL对猪卵母细胞线粒体含量的影响 |
| 2.3 TCEP-HCL对猪卵母细胞细胞凋亡的影响 |
| 2.4 TCEP-HCL对体外受精囊胚细胞凋亡的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）哺乳动物卵母细胞染色质构型分类与发育能力的关系研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.1.1 核成熟与胞质成熟 |
| 1.1.2 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.1.3 卵母细胞胞质成熟的标志 |
| 1.1.4 影响卵母细胞成熟和发育的因素 |
| 1.2 卵母细胞生发泡染色质构型 |
| 1.2.1 卵母细胞生发泡 |
| 1.2.2 卵母细胞染色质构型的概念 |
| 1.2.3 卵母细胞染色质构型的分类 |
| 1.2.4 卵母细胞生长和成熟期间GV染色质构型变化 |
| 1.2.5 卵母细胞染色质构型与转录活性的关系 |
| 1.2.6 卵母细胞染色质构型与发育能力的关系 |
| 1.2.7 卵母细胞染色质构型与卵泡闭锁的关系 |
| 1.2.8 其他影响卵母细胞染色质构型的因素 |
| 1.3 玉米赤霉烯酮对卵母细胞发育能力的影响 |
| 1.3.1 玉米赤霉烯酮对雌性动物生殖的影响 |
| 1.3.2 玉米赤霉烯酮对卵母细胞纺锤体组装与染色体整倍性的影响 |
| 1.3.3 玉米赤霉烯酮与氧化应激 |
| 1.3.4 玉米赤霉烯酮与染色体畸变 |
| 1.3.5 玉米赤霉烯酮与基因转录 |
| 1.4 本研究的主要内容和目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂及配制 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物饲养及小鼠超排处理 |
| 2.2.2 小鼠玉米赤霉烯酮注射方案 |
| 2.2.3 猪卵巢的收集与处理 |
| 2.2.4 猪健康卵泡与闭锁卵泡的判定 |
| 2.2.5 卵母细胞的收集 |
| 2.2.6 卵母细胞生发泡染色质构型的观察 |
| 2.2.7 猪卵丘细胞凋亡检测 |
| 2.2.8 卵母细胞体外培养 |
| 2.2.9 卵母细胞的孤雌激活和胚胎培养 |
| 2.2.10 小鼠卵母细胞ROS水平检测 |
| 2.2.11 小鼠卵母细胞MI期纺锤体染色 |
| 2.2.12 小鼠MII期卵母细胞染色体延展 |
| 2.2.13 小鼠卵母细胞JC-1染色 |
| 2.2.14 小鼠卵母细胞谷胱甘肽水平检测 |
| 2.2.15 总体转录活性的检测 |
| 2.2.16 荧光定量PCR |
| 2.2.17 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪和小鼠卵母细胞GV染色质构型分类 |
| 3.1.1 猪卵母细胞GV染色质构型分类 |
| 3.1.2 小鼠卵母细胞GV染色质构型分类 |
| 3.2 猪不同大小卵泡卵母细胞GV染色质构型和体外成熟率 |
| 3.2.1 猪1-2mm和3-6mm卵泡的卵母细胞GV染色质构型 |
| 3.2.2 猪1-2mm和3-6mm卵泡的卵母细胞体外成熟率 |
| 3.3 猪健康和闭锁卵泡卵母细胞GV染色质构型和体外成熟率 |
| 3.3.1 猪健康和闭锁卵泡的卵母细胞的形态学判定 |
| 3.3.2 猪健康和闭锁卵泡的卵丘细胞凋亡情况 |
| 3.3.3 猪卵巢直径1-2mm健康和闭锁卵泡卵母细胞GV染色质构型比例 |
| 3.3.4 猪1-2mm健康和闭锁卵泡卵母细胞体外成熟率 |
| 3.3.5 猪卵巢3-6mm健康和闭锁卵泡卵母细胞GV染色质构型比例 |
| 3.3.6 猪3-6mm健康和闭锁卵泡卵母细胞体外成熟率 |
| 3.4 卵巢处理对猪卵母细胞GV染色质构型和体外成熟的影响 |
| 3.4.1 卵巢处理对猪卵母细胞GV染色质构型的影响 |
| 3.4.2 卵巢处理对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.5 猪卵母细胞体外培养过程中染色质构型的动态改变 |
| 3.5.1 猪1-2mm健康卵泡卵母细胞体外培养过程中的染色质构型转变 |
| 3.5.2 猪3-6mm健康卵泡卵母细胞体外培养过程中的染色质构型变化 |
| 3.5.3 猪1-2mm闭锁卵泡卵母细胞体外培养过程中的染色质构型变化 |
| 3.6 培养基对猪卵母细胞GV染色质构型和体外成熟的影响 |
| 3.6.1 培养基对猪1-2mm健康卵泡卵母细胞染色质构型的影响 |
| 3.6.2 培养基对猪1-2mm健康卵泡卵母细胞成熟率的影响 |
| 3.6.3 培养基对猪3-6mm健康卵泡卵母细胞染色质构型的影响 |
| 3.6.4 培养基对猪3-6mm健康卵泡卵母细胞成熟率的影响 |
| 3.7 猪卵母细胞不同染色质构型的整体转录活性 |
| 3.7.1 猪卵母细胞染色质构型与转录活性的关系 |
| 3.7.2 猪卵母细胞各染色质构型发生转录活动的比例 |
| 3.8 Roscovitine抑制GVBD后的猪卵母细胞染色质构型和发育能力 |
| 3.8.1 Roscovitine抑制GVBD后的猪卵母细胞染色质构型 |
| 3.8.2 Roscovitine抑制GVBD后的猪卵母细胞体外发育能力 |
| 3.9 猪卵母细胞GV染色质构型的转变通路 |
| 3.10 ZEN对猪卵母细胞体外成熟和染色质构型的影响 |
| 3.10.1 ZEN对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.10.2 ZEN对猪卵母细胞染色质构型的影响 |
| 3.11 ZEN对小鼠卵母细胞体外成熟胚胎发育能力的影响 |
| 3.12 ZEN暴露对小鼠卵母细胞纺锤体形态的影响 |
| 3.12.1 ZEN暴露对小鼠卵母细胞MI期纺锤体形态的影响 |
| 3.12.2 ZEN暴露对小鼠卵母细胞染色体整倍性的影响 |
| 3.13 ZEN暴露对小鼠卵母细胞内氧化还原水平的影响 |
| 3.13.1 ZEN暴露对小鼠卵母细胞内谷胱甘肽水平的影响 |
| 3.13.2 ZEN暴露对小鼠卵母细胞内谷胱甘肽水平的影响 |
| 3.13.3 ZEN暴露对小鼠卵母细胞内线粒体膜电位的影响 |
| 3.14 ZEN暴露对小鼠卵母细胞GV染色质构型的影响 |
| 3.15 ZEN暴露对小鼠卵母细胞GV期基因转录水平的影响 |
| 3.15.1 ZEN暴露后小鼠卵母细胞各染色质构型与转录活动 |
| 3.15.2 ZEN暴露对小鼠不同构型卵母细胞发生转录比例的影响 |
| 3.15.3 ZEN暴露对不同构型卵母细胞的转录强度的影响 |
| 3.15.4 ZEN对小鼠卵母细胞发育能力、纺锤体组装、氧化还原能力和凋亡相关基因表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 卵母细胞染色质构型的新分类 |
| 4.1.1 猪卵母细胞染色质构型的新分类 |
| 4.1.2 小鼠卵母细胞染色质构型的新分类 |
| 4.2 卵母细胞染色质构型转变与发育能力的关系 |
| 4.2.1 生长过程中的卵母细胞染色质构型转变与发育能力的关系 |
| 4.2.2 卵巢处理后的卵母细胞染色质构型转变与发育能力的关系 |
| 4.2.3 闭锁卵泡中的卵母细胞染色质构型转变与发育能力的关系 |
| 4.2.4 体外培养过程中的卵母细胞染色质构型转变与发育能力的关系 |
| 4.2.5 不同培养基中卵母细胞染色质构型转变与发育能力的关系 |
| 4.3 各染色质构型的整体转录水平转录与发育能力 |
| 4.4 ZEN体内暴露模型的有效性 |
| 4.5 ZEN暴露损害卵母细胞的发育能力 |
| 4.6 ZEN破坏卵母细胞纺锤体组装和染色体分离 |
| 4.7 ZEN引起卵母细胞氧化应激 |
| 4.8 ZEN引起卵母细胞染色质构型提前凝集 |
| 4.9 ZEN引起卵母细胞基因转录水平下降 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（5）PI3K/Akt信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.卵母细胞体外成熟的研究进展 |
| 1.1 卵母细胞成熟过程 |
| 1.2 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 2.PI3K/Akt信号通路对卵母细胞成熟的影响 |
| 2.1 PI3K/Akt信号通路的研究进展 |
| 2.2 PI3K/Akt信号通路对卵母细胞成熟的影响 |
| 3.研究目的及意义 |
| 第二章 激活剂EGF对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 前言 |
| 1.试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 结果生物统计与分析 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 激活剂EGF对猪卵丘细胞扩展的影响 |
| 2.2 激活剂EGF对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后胚胎发育的影响 |
| 2.3 10 ng/mL EGF对猪卵母细胞成熟相关基因表达的影响 |
| 2.4 10 ng/mL EGF对猪卵母细胞p-Akt~(Thr308)蛋白表达的影响 |
| 3.讨论与分析 |
| 3.1 激活剂EGF对猪卵丘扩展和卵母细胞成熟的影响 |
| 3.2 10ng/mL EGF对猪卵母细胞成熟相关基因和p-Akt~(Thr308)蛋白水平的影响 |
| 4.小结 |
| 第三章 激活剂PS48对猪卵母细胞体外成熟及卵丘细胞增殖的影响 |
| 前言 |
| 1.试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 结果统计与分析 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 激活剂PS48对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.2 10μM PS48对卵母细胞成熟相关基因表达的影响 |
| 2.3 10μM PS48 对猪卵母细胞p-Akt~(Thr308)和Akt蛋白表达的影响 |
| 2.4 不同浓度PS48对猪卵丘细胞扩展以及增殖的影响 |
| 2.5 10μM PS48对猪卵丘细胞增殖、凋亡、周期相关基因表达及线粒体膜电位的影响 |
| 3.讨论与分析 |
| 3.1 激活剂PS48对猪卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.2 10μM PS48 对猪卵母细胞成熟相关基因以及p-Akt~(Thr308)和Akt表达的影响 |
| 3.3 10μM PS48对猪卵丘细胞增殖、凋亡、周期相关基因表达及线粒体膜电位的影响 |
| 4.小结 |
| 第四章 抑制剂LY294002对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 前言 |
| 1.试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 结果统计与分析 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 抑制剂LY294002对猪卵丘颗粒细胞扩展的影响 |
| 2.2 抑制剂LY294002对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.3 50μM LY294002对猪卵母细胞成熟相关基因表达的影响 |
| 2.4 50μM LY294002 对猪卵母细胞Akt和 p-Akt~(Thr308)蛋白表达的影响 |
| 2.5 50μM LY294002对猪囊胚细胞数的影响 |
| 3.讨论与分析 |
| 3.1 抑制剂LY294002对猪卵丘细胞扩展和卵母细胞成熟的影响 |
| 3.2 50μM LY294002 对猪卵母细胞成熟相关基因、Akt、p-Akt~(Thr308)蛋白表达及囊胚细胞数的影响 |
| 4.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表学术论文 |
（6）维生素A对猪卵母细胞成熟及胚胎早期发育的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪卵母细胞的成熟对胚胎早期发育的影响 |
| 1.1 猪卵母细胞的体外成熟研究 |
| 1.2 猪卵母细胞的获取对体外成熟的影响 |
| 1.3 猪卵母细胞的培养基对体外成熟的影响 |
| 1.4 培养环境对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 第二章 维生素对卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响 |
| 2.1 维生素A对卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响 |
| 2.1.1 维生素A对卵母细胞成熟的影响 |
| 2.1.2 维生素A对囊胚发育的影响 |
| 2.1.3 维生素A对卵母细胞线粒体膜电位和ROS水平的影响 |
| 2.1.4 维生素A对卵丘细胞凋亡的影响 |
| 2.1.5 维生素A对抗氧化剂相关基因的影响 |
| 2.2 维生素B6对卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响 |
| 2.3 维生素C对卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响 |
| 2.4 维生素D对卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响 |
| 2.5 维生素E对卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 维生素A对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验仪器与器材 |
| 1.1.2 实验试剂及配制方法 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 猪卵巢的获取 |
| 1.2.2 猪卵母细胞的收集 |
| 1.2.3 卵母细胞的成熟 |
| 1.2.4 不同IVM液的配制 |
| 1.2.5 ROS荧光强度的检测 |
| 1.2.6 GSH荧光强度的检测 |
| 1.2.7 RT-qPCR检测细胞内RAR、GSH的表达 |
| 1.2.8 数据分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 维生素对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 1.3.2 维生素A对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 维生素A对卵母细胞早期胚胎发育的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验仪器与器材 |
| 2.1.2 实验试剂及配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 孤雌激活 |
| 2.2.2 体细胞核移植 |
| 2.2.3 体外受精 |
| 2.2.4 免疫荧光 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 维生素A对孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.3.2 维生素A对 SCNT胚胎发育的影响 |
| 2.3.3 维生素A对 IVF胚胎发育的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）猪IVF胚胎早期卵裂时间对其发育潜能影响的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 综述部分 |
| 1 猪卵母细胞的体外成熟、培养与体外受精(IVF) |
| 1.1 卵母细胞的质量 |
| 1.2 卵母细胞进行体外成熟(IVM)培养 |
| 1.3 猪卵母细胞的体外受精(IVF)的研究进展 |
| 1.4 猪IVF胚胎的多精受精现象 |
| 2 胚胎早期卵裂 |
| 2.1 哺乳动物早期胚胎的生长发育 |
| 2.2 早期卵裂胚胎研究现状 |
| 3 单细胞转录组测序技术(single-cell RNA-seq,sc RNA-seq) |
| 3.1 单细胞转录组测序的研究进展 |
| 3.2 不同物种间早期胚胎的研究现状 |
| 4 早、晚期卵裂胚胎与发育潜能的关系 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第二章 初次卵裂时间对猪IVF胚胎发育潜能的影响 |
| 1 材料与仪器设备 |
| 1.1 试验主要材料 |
| 1.2 试验设计与分组 |
| 1.3 试验主要试剂 |
| 1.4 主要溶液 |
| 1.5 仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 猪COCs的收集与IVM |
| 2.2 猪卵母细胞的IVF |
| 2.3 初次卵裂胚胎分离培养 |
| 2.4 统计分析方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪IVF胚胎不同时间的卵裂数 |
| 3.2 猪IVF胚胎不同卵裂时间的囊胚率 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 猪IVF早、晚期卵裂胚胎对多能基因和凋亡基因表达水平影响的初步研究 |
| 1 材料与仪器设备 |
| 1.1 试验主要材料 |
| 1.2 试验设计与分组 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 1.5 主要溶液 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 设计QRT-PCR引物 |
| 2.2 初次卵裂胚胎分离培养 |
| 2.3 收集猪IVF早、晚期卵裂胚胎 |
| 2.4 样品微量反转 |
| 2.5 溶解稀释QRT-PCR引物 |
| 2.6 设计QRT-PCR反应体系 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 早、晚期二分裂胚胎中Oct4、Sox2、Klf4 的特异性检测 |
| 3.2 早、晚期二分裂胚胎中Oct4、Sox2、Klf4 差异表达结果 |
| 3.3 早、晚期二分裂胚胎中Bcl-xl和 Caspase-3 的特异性检测 |
| 3.4 早、晚期二分裂胚胎中Bcl-xl和 Caspase-3 的差异表达结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪IVF早、晚期二分裂胚胎Oct4、Sox2和Klf4 的差异表达 |
| 4.2 猪IVF早、晚期二分裂胚胎Caspase-3、Bcl-xl的差异表达 |
| 5 小结 |
| 第四章 单细胞转录组测序技术对早晚期卵裂胚胎初步研究 |
| 1 材料与仪器设备 |
| 1.1 试验主要材料 |
| 1.2 试验设计与分组 |
| 1.3 试验主要试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 样品的收集 |
| 2.2 样品构建文库、测序 |
| 2.3 分析方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 质量检验 |
| 3.2 Clean/Raw Data数据量 |
| 3.3 基因比对、组装分析 |
| 3.4 Cuffdiff差异表达分析 |
| 3.5 GO富集分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）CXCL12、VEGFA和WNT5A优化猪卵母细胞体外成熟体系及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 问题的由来 |
| 1.2 卵母细胞成熟过程 |
| 1.2.1 卵母细胞核成熟 |
| 1.2.2 卵母细胞质成熟 |
| 1.2.3 颗粒细胞扩展 |
| 1.3 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.3.1 动物本身的状况 |
| 1.3.2 卵巢采集月份 |
| 1.3.3 卵母细胞获得方式 |
| 1.3.4 温度和渗透压 |
| 1.3.5 卵丘卵母细胞复合体的质量 |
| 1.4 卵母细胞体外成熟培养液开发及优化 |
| 1.4.1 常用IVM培养液 |
| 1.4.2 添加猪卵泡液 |
| 1.4.3 添加激素 |
| 1.4.4 添加细胞因子和生长因子 |
| 1.5 血管内皮生长因子 |
| 1.5.1 VEGF在生殖系统中的研究 |
| 1.6 基质衍生因子 |
| 1.6.1 CXCL12在生殖系统中的研究 |
| 1.7 WNT5A |
| 1.7.1 WNT5A在生殖系统中的研究 |
| 1.8 丝裂原活化蛋白激酶信号通路 |
| 1.9 WNT信号通路 |
| 1.10 早期胚胎发育历程 |
| 1.10.1 IVM卵母细胞决定早期胚胎发育能力 |
| 1.11 研究目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 抗体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪卵母细胞体外收集与培养 |
| 2.2.2 孤雌激活以及早期胚胎体外培养 |
| 2.2.3 体外受精和早期胚胎体外培养 |
| 2.2.4 纺锤体染色 |
| 2.2.5 皮质颗粒分布 |
| 2.2.6 早期卵母细胞凋亡检测 |
| 2.2.7 卵母细胞TZPs分析 |
| 2.2.8 免疫荧光染色 |
| 2.2.9 囊胚凋亡检测 |
| 2.2.10 卵丘扩展鉴定 |
| 2.2.11 试剂盒提取RNA |
| 2.2.12 反转录 |
| 2.2.13 实时荧光定量PCR |
| 2.2.14 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.15 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 利用猪生殖道转录组分析确定细胞因子 |
| 3.2 确定CVW对 IVM卵母细胞影响的最适浓度 |
| 3.3 CVW促进IVM卵母细胞PB1 排出 |
| 3.4 CVW提高IVM卵母细胞质量 |
| 3.5 CVW促进IVM卵丘扩展 |
| 3.6 CVW降低IVM卵母细胞多精受精 |
| 3.7 CVW提前激活IVM中 MAPK通路并调节WNT信号通路 |
| 3.8 CVW促进IVM卵母细胞发育能力 |
| 3.9 CVW提高IVM卵母细胞随后发育质量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 选择CVW的可行性 |
| 4.2 CVW对猪IVM的优化作用 |
| 4.3 CVW对猪IVM的优化机制 |
| 4.4 CVW提高卵母细胞的发育潜力 |
| 5 结论 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 论文的创新与不足之处以及下一步计划 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 颗粒细胞和卵母细胞在哺乳动物卵泡闭锁和激素分泌中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵巢的基本结构和功能 |
| 1.1.2 卵泡发育的基本过程 |
| 1.1.3 卵泡发育的调控途径 |
| 1.1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.5 卵母细胞的发育以及在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.6 颗粒细胞与卵母细胞的互作 |
| 1.2 Wnt-Ca~(2+)信号通路对卵泡发育的影响 |
| 1.2.1 Wnt通路概述以及Wnt-Ca~(2+)通路的组成 |
| 1.2.2 Wnt-Ca~(2+)通路在哺乳动物生理病理活动中的调节作用 |
| 1.2.3 Wnt-Ca~(2+)与Wnt典型通路的互作 |
| 1.2.4 Wnt-Ca~(2+)与其它信号通路的关系 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 Wnt/PLC/Ca~(2+)信号变化对猪颗粒细胞活力和卵母细胞成熟的调控 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.2.3 试验动物来源 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 猪卵巢的采集 |
| 2.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 2.3.3 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.3.4 CCK8法测定颗粒细胞活力 |
| 2.3.5 卵母细胞成熟的判定 |
| 2.3.6 孤雌激活和早期胚胎培养 |
| 2.3.7 早期胚胎发育的评定 |
| 2.3.8 统计学数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.4.2 不同浓度IWP-2对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.3 不同浓度抑制剂U73122对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.4 不同浓度激活剂m-3M3FBS对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.5 不同浓度IWP-2对猪卵母细胞第一极体排出率的影响 |
| 2.4.6 不同浓度抑制剂U73122 或激活剂m-3M3FBS对卵母细胞成熟的影响. |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 IWP-2对Wnt/PLC/Ca~(2+)通路的抑制、对凋亡的促进及其对颗粒细胞激素的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 猪卵巢的采集以及猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 3.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度的测定 |
| 3.3.3 猪颗粒细胞RNA提取和反转录 |
| 3.3.4 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因和激素调控基因的表达水平 |
| 3.3.5 Western Blot法检测凋亡相关蛋白和PLC四种亚基蛋白表达水平 |
| 3.3.6 统计学数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞中Ca~(2+)浓度的影响 |
| 3.4.2 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的影响 |
| 3.4.3 IWP-2对颗粒细胞雌二醇和孕酮调控基因的影响 |
| 3.4.4 IWP-2 对猪颗粒细胞和卵母细胞PLC四种亚基基因和蛋白表达的影响. |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 PLC蛋白对猪卵泡发育过程中细胞凋亡、激素分泌和Wnt/Ca~(2+)信号通路的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 4.3.2 颗粒细胞和卵母细胞的总RNA提取和反转录 |
| 4.3.3 实时荧光定量PCR检测凋亡、激素和Wnt/Ca~(2+)通路若干基因的表达 |
| 4.3.4 Western Blot法检测凋亡和Wnt/Ca~(2+)通路相关蛋白的表达 |
| 4.3.5 Annexin V-FITC法检测猪颗粒细胞凋亡 |
| 4.3.6 酶联免疫法(ELISA法)测定猪雌二醇和孕酮的含量 |
| 4.3.7 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度测定 |
| 4.3.8 统计学数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的调控 |
| 4.4.2 PLC蛋白对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的调控 |
| 4.4.3 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞Wnt/Ca~(2+)信号中PLC四个亚基、Ca~(2+)浓度、三个钙离子敏感蛋白和若干下游基因的调控 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 IWP-2与U73122或m-3M3FBS互作对猪卵泡Ca~(2+)的调节以及对颗粒细胞凋亡和激素的调节作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 5.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度检测 |
| 5.3.3 颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 5.3.4 实时荧光定量PCR检测颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 5.3.5 统计学数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对猪颗粒细胞和卵母细胞Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.4.2 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞凋亡调控基因的影响 |
| 5.4.3 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞激素调控基因的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 Enzastaurin或 Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞激素和凋亡的调节作用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要试验仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞的培养 |
| 6.3.2 猪颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 6.3.3 实时荧光定量PCR检测猪颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 6.3.4 Western Blot法检测猪颗粒细胞PKC蛋白表达的影响 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 Enzastaurin对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 6.4.2 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响 |
| 6.4.3 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮激素相关基因表达的影响 |
| 6.4.4 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对PKCβ蛋白表达的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 下一步研究工作 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）基于卵巢全转录组学和代谢组学筛选影响猪产仔数性状的候选基因、非编码RNA及miR-183-circTCP1轴的功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖力及卵巢生殖调控功能研究进展 |
| 1.1.1 猪繁殖力关键性状及相关基因研究进展 |
| 1.1.2 母猪卵巢生殖调控功能研究进展 |
| 1.2 猪繁殖力相关转录组学研究进展 |
| 1.2.1 在转录组学中应用的测序技术 |
| 1.2.2 猪繁殖力相关mRNA研究进展 |
| 1.2.3 猪繁殖力相关非编码RNA研究进展 |
| 1.3 猪繁殖力相关代谢组学研究 |
| 1.3.1 代谢组学介绍 |
| 1.3.2 代谢组学的分类 |
| 1.3.3 影响猪繁殖力的有效代谢物研究 |
| 1.3.4 代谢组学在繁殖力相关疾病诊断和预防中的应用 |
| 1.4 猪遗传育种与多组学整合分析研究进展 |
| 1.4.1 基因组学和转录组学整合分析在猪遗传育种中的应用 |
| 1.4.2 转录组学和代谢组学整合分析在猪遗传育种中的应用 |
| 1.4.3 转录组学和蛋白质组学整合分析在猪遗传育种中的应用 |
| 1.4.4 代谢组学和蛋白质组学整合分析在猪遗传育种中的应用 |
| 1.4.5 两个以上组学整合分析在猪遗传育种中的应用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 基于卵巢全转录组学筛选影响母猪产仔数性状关键候选基因 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 卵巢组织总RNA提取 |
| 2.1.3 总RNA质量检测 |
| 2.1.4 文库构建 |
| 2.1.5 测序 |
| 2.1.6 全转录组测序数据质量控制及分析 |
| 2.1.7 差异表达基因的分析和ce RNA关系预测 |
| 2.1.8 功能分析 |
| 2.1.9 cDNA合成 |
| 2.1.10 实时定量PCR(Real-time quantitative PCR) |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 总RNA质量检测结果 |
| 2.2.2 测序数据的质量控制 |
| 2.2.3 Mapping结果统计 |
| 2.2.4 基因组的结构分析 |
| 2.2.5 Reads在染色体上的分布 |
| 2.2.6 高产猪和低产猪卵巢中差异基因分析 |
| 2.2.7 测序数据的RT-qPCR验证 |
| 2.2.8 SLS和 LLS猪卵巢组织的GO功能富集分析和通路分析 |
| 2.2.9 候选基因的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 基于卵巢全转录组学筛选影响猪产仔数的关键候选非编码RNA |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 卵巢组织RNA提取 |
| 3.1.3 cDNA合成 |
| 3.1.4 实时定量PCR |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 高产猪和低产猪卵巢中差异miRNA分析 |
| 3.2.2 miRNA的 RT-qPCR验证 |
| 3.2.3 高产猪和低产猪卵巢中差异lncRNA分析 |
| 3.2.4 lncRNA的 RT-qPCR验证 |
| 3.2.5 高产猪和低产猪卵巢中差异circRNA分析 |
| 3.2.6 circRNA的 RT-qPCR验证 |
| 3.2.7 lncRNA-miRNA-mRNA和 circRNA-miRNA-mRNA的网络分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 基于卵巢代谢组学筛选影响猪产仔数性状的关键代谢物及其候选关键基因 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 卵巢组织代谢物提取 |
| 4.1.3 色谱条件 |
| 4.1.4 质谱条件 |
| 4.1.5 代谢物的鉴定 |
| 4.1.6 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 QC样本质控 |
| 4.2.2 总样品PCA分析 |
| 4.2.3 各组代谢物表达水平分布 |
| 4.2.4 偏最小二乘法判别分析(PLS-DA) |
| 4.2.5 差异代谢物分析 |
| 4.2.6 差异代谢物的KEGG富集分析 |
| 4.2.7 代谢组学和转录组学联合分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-183 在高产性母猪卵巢中的功能和miR-183-circTCP1 轴的鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 实验试剂的配置 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.1.4 猪卵巢颗粒细胞的培养及转染 |
| 5.1.5 总RNA的提取及反转录 |
| 5.1.6 总蛋白的提取及蛋白免疫印迹 |
| 5.1.7 实时荧光定量PCR |
| 5.1.8 CCK-8 实验 |
| 5.1.9 EdU实验 |
| 5.1.10 流式细胞检测 |
| 5.1.11 构建ce RNA网络 |
| 5.1.12 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 5.1.13 双荧光素酶报告基因活性分析 |
| 5.1.14 数据统计与分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 miR-183 的序列保守性分析 |
| 5.2.2 miR-183 促进卵巢颗粒细胞P4 的合成分泌而降低E2 的合成分泌 |
| 5.2.3 过表达miR-183 促进卵巢颗粒细胞增殖 |
| 5.2.4 过表达miR-183 对卵巢功能基因表达的影响 |
| 5.2.5 过表达miR-183 影响细胞周期相关基因的表达 |
| 5.2.6 过表达miR-183 对细胞凋亡的影响 |
| 5.2.7 circRNA-miRNA轴的鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 后续研究 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、猪卵巢卵母细胞的收集和体外成熟培养（论文参考文献）
- [1]ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达与功能研究[D]. 曹丽华. 广西大学, 2021(01)
- [2]GGT1不同剪接体鉴定及其对哺乳动物卵泡发育和排卵的功能研究[D]. 王玲. 华中农业大学, 2021
- [3]三（2-羧基乙基）膦盐酸盐处理对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育能力的影响研究[D]. 曾毅仁. 广西大学, 2020(07)
- [4]哺乳动物卵母细胞染色质构型分类与发育能力的关系研究[D]. 潘柳竹. 山东农业大学, 2020(02)
- [5]PI3K/Akt信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响[D]. 焦亚飞. 广西大学, 2020(02)
- [6]维生素A对猪卵母细胞成熟及胚胎早期发育的影响[D]. 陈雪. 吉林大学, 2020(08)
- [7]猪IVF胚胎早期卵裂时间对其发育潜能影响的初步研究[D]. 李田田. 广西大学, 2020(02)
- [8]CXCL12、VEGFA和WNT5A优化猪卵母细胞体外成熟体系及机制研究[D]. 郝宇晨. 华中农业大学, 2020(02)
- [9]Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制[D]. 陈华丽. 西北农林科技大学, 2020
- [10]基于卵巢全转录组学和代谢组学筛选影响猪产仔数性状的候选基因、非编码RNA及miR-183-circTCP1轴的功能验证[D]. 徐高骁. 西北农林科技大学, 2019