一、补体膜辅蛋白的研究进展（论文文献综述）
舒银珍,全晖,曾志荣[1]（2022）在《Hcy、hs-CRP及LDLC联合检测对冠心病的诊断价值》文中指出目的研究同型半胱氨酸（Hcy）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）及低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）联合检测对冠心病（CHD）的诊断价值。方法回顾性分析90例CHD患者临床资料,根据病情将其分为稳定型心绞痛（SAP）组42例、不稳定型心绞痛（UAP）组29例及急性心肌梗死（AMI）组19例;将同期30例行冠状动脉造影检查排除CHD的非心脑血管疾病患者纳入对照组。应用受试者工作曲线（ROC曲线）评价Hcy、hs-CRP、LDLC及三者联合对CHD的诊断价值。结果 Hcy、hs-CRP、LDLC ROC曲线显示AUC分别为0.832、0.895、0.747（P均<0.05）,灵敏度分别为0.667、0.867、0.767,特异度分别为0.900、0.800、0.667。3者联合预测AUC为0.971,灵敏度、特异度分别为0.878、1.000,优于各自单独预测（P<0.05）。肌酸激酶同工酶（CKMB）、肌钙蛋白T（cTnT）、肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）诊断CHD的灵敏度分别为0.889、0.867、0.878,特异度分别为0.667、0.633、0.600,与上述Hcy、hs-CRP、LDLC诊断价值相近;3种心肌酶谱联合诊断CHD的灵敏度、特异度分别为0.889、0.833略低于Hcy、hs-CRP、LDLC联合诊断价值。结论血清Hcy、hs-CRP、LDLC水平与CHD发生、发展密切相关,联合检测对CHD诊断有一定价值。
李玉凤[2]（2021）在《血清补体因子及补体调节蛋白与DKD的相关性研究》文中研究指明[目 的]观察血清补体因子（C1q、C3a、C5a、MBL和MAC）和血清补体调节蛋白（CD59、CD46）与糖尿病肾脏疾病的关系,评估其对早期糖尿病肾脏疾病的诊断价值和对肾功进展的预测价值。[方 法]纳入2020年6月至2020年12月昆明医科大学第二附属医院内分泌科及肾内科住院的312例患者,将患者分为A组:单纯糖尿病;B组:糖尿病肾脏疾病;C组:慢性肾脏疾病（除外糖尿病肾脏疾病）。（再将B组分为:30mg/g≤UACR<300mg/g 或 60ml·min-1·（1.73m2）-1≤eGER<90ml·min-1·（1.73m2）-1;B-2 组:UACR>3 00mg/g或eGER<60ml·min-1·（1.73m2）-1）。采用酶联免疫试验（ELISA）检测5种血清补体因子（C1q、C3a、C5a、MBL和MAC）和2种血清补体调节蛋白（CD59、CD46）。收集患者的临床资料及实验室资料,包括:人口学资料（如:性别、年龄、身高、体重、原发性疾病）及实验室指标（如:血清白蛋白、血肌酐、血尿素氮、总胆固醇、甘油三酯、血尿酸、血白细胞、血红蛋白）。以EPI公式估算肾小球滤过率。统计方法采用SPSS25.0统计软件进行数据分析,比较各组患者的临床资料及血清补体,对肾功能指标与血清补体进行Spearman相关分析,早期糖尿病肾脏疾病的影响因素分析用单因素和多因素Logistic回归分析,采用受试者工作特征（ROC）曲线评估血清补体对早期糖尿病肾脏疾病的诊断值。以P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1.A、B、C三组的临床资料及血清补体比较312例患者中,患者平均年龄为（54.7±15.5）岁,男性176例（56.4%）,女性136例（43.6%）,其中A组125例（40%）、B组76例（24%）和C组111例（36%）,三组间性别、血小板、白细胞和总胆固醇差异无统计学意义（均P>0.05）,B组患者年龄最高;血红蛋白、白蛋白、甘油三酯、肾小球滤过率、体质量指数水平A组最高,C组最低;血尿素氮、血肌酐、血尿酸、收缩压及舒张压则相反A组最低,C组最高;补体因子C1q、C3a、C5a、MBL、MAC水平均为B组最高,血清补体调节蛋白CD59水平B组最低,CD46水平B、C组均高,差异有统计学意义（均P<0.05）。进一步将血清补体进行组间两两比较,B组分别与A组,C组比较,补体因子C1q、C3a、C5a、MBL、MAC水平B组显着升高,CD59显着降低,差异有统计学意义（均P<0.05）;而A组与C组比较上述补体因子水平均无统计学差异。2.1.A组和B-1组、B-2组临床资料及血清补体比较201例患者平均年龄为（58.3±18.6）岁,男性117例（58.2%）,女性84例（41.8%）,其中 A 组 125 例（62.2%）和 B-1 组 33 例（16.4%）、B-2 组 43 例（21.4%）,白细胞、血尿素氮、血肌酐、收缩压和血清补体因子C1q、C3a、C5a、MBL、MAC水平由A组向B-2组逐渐升高;血红蛋白、白蛋白、肾小球滤过率和血清补体调节蛋白CD59水平则随之降低,而CD46水平则B-1、B-2组均高。进一步将A组与B-1组进行组间比较,B-1组上述补体因子均显着升高;CD59水平显着降低,差异具有统计学意义（均P<0.05）,CD46则无统计学差异（P>0.05）。2.2.血清补体与肾功能指标的相关性（Spearman相关分析）将A组与B-1组与B-2组的血清补体与肾功能相关指标进行Spearman相关分析结果显示,血清补体因子C1q、C3a、C5a、MBL和MAC均与血红蛋白、白蛋白及肾小球滤过率呈负相关;与血尿素氮、血肌酐、血尿酸、尿白蛋白呈正相关;血清补体调节蛋白CD59与血尿酸及尿白蛋白呈负相关;CD46与尿白蛋白呈正相关,差异均具有统计学意义（均P<0.05）。2.3.早期糖尿病肾脏疾病的影响因素分析将A组与B-1组组间比较中有意义（d:P<0.05）纳入到单因素logistic回归中,单因素logistic回归中有意义的进一步纳入多因素Logistic回归分析后结果显示:血清补体因子 C1q（OR=1.032,95%CI 1.016～1.049,P<0.001）、MBL（OR=1.007,95%CI 1.002～1.012,P=0.012）、MAC（OR=1.01,95%CI 1.003～1.016,P=0.003）均是早期糖尿病肾脏疾病的独立危险因素。肾小球滤过率（OR=1.032,95%CI 1.016～1.049,P<0.001）和血清补体调节蛋白 CD59（OR=0.958,95%CI 0.924～0.922,P=0.017）是早期糖尿病肾脏疾病的独立保护因素。2.4.血清补体对早期糖尿病脏疾病的诊断价值ROC曲线结果显示,血清C1q、MBL、MAC及CD59诊断早期糖尿病肾脏疾病的灵敏度分别为84.8%、87.9%、93.9%、39.4%;特异度分别为80.0%、74.4%、79.2%、98.4%;ROC 曲线显示下的 AUC 依次为 0.893、0.828、0.908、0.730,其中MAC的AUC最大（0.908）。[结论]1.血清补体与糖尿病肾脏疾病的关系:糖尿病肾损伤的患者中存在整体补体活化现象,且在早期糖尿病肾脏疾病即出现循环补体活化,并与肾脏损伤程度相关。2.血清补体与糖尿病肾功指标的关系:血清补体因子与肾功能指标呈强相关,且血清补体因子及补体调节蛋白均与尿微量白蛋白/尿肌酐比值明显相关。表明血清补体在监测肾功进展、评估肾脏损伤程度具有积极意义。3.血清补体对早期糖尿病肾脏疾病的预测价值:血清补体因子C1q、MBL及MAC是早期糖尿病肾脏疾病的独立危险因素;血清补体调节蛋白CD59是早期糖尿病肾脏疾病的独立保护因素。4.血清补体对早期糖尿病肾脏疾病的诊断价值:ROC曲线结果显示,血清C1q、MBL、MAC及CD59曲线下面积均大于0.7,灵敏度特异度均高,其中MAC的AUC最大,表明可能通过调节补体系统的新方法寻找新的治疗靶点进而开发新的药物干预糖尿病肾脏疾病的进展。
杨阳,苗留飞,李晓军[3]（2020）在《补体在肾小球疾病精准医疗中的临床意义》文中研究表明补体系统的异常活化,包括补体活性异常、抗补体抗体和补体相关基因的遗传突变等,是肾小球疾病发病机制之一。目前,补体成分和活性的检测是肾小球疾病重要的辅助诊断指标,有助于肾小球疾病的诊断、鉴别诊断和分型。本文总结了肾小球疾病发病过程中补体异常活化、补体检测方法及在肾小球疾病诊疗中的意义,为肾小球疾病的精准医疗提供依据。
李璐璐[4]（2020）在《膜锚定补体调节蛋白CD46，CD55和CD59在口腔扁平苔藓中表达的研究》文中研究表明目的:1.研究膜锚定补体调节蛋白（Membrane-bound complement regulatory proteins,mCRPs）CD46,CD55和CD59在口腔扁平苔藓（Oral lichen planus,OLP）局部病变组织中的表达,探索mCRPs与OLP发病的相关性。2.体外实验研究mCRPs在体外分离培养的原代OLP口腔角质形成细胞中的表达,并探索不同浓度及不同时间脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激对CD46,CD55和CD59转录水平的影响。进一步探讨mCRPs表达异常与OLP的相关性,为OLP的发生机制及早期诊治提供新思路。方法:1.实验组纳入37例OLP患者（非糜烂型20例,糜烂型17例）,对照组纳入20例健康对照者,并对OLP患者口内病损程度进行REU评分。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）及Western blotting检测CD46,CD55和CD59 mRNA和蛋白在OLP病变组织中的表达,酶联免疫吸附实验检测OLP患者血清及唾液中补体C3和sC5b-9的表达水平以评估补体激活状态,并分析以上各指标与REU评分的相关性。2.另纳入3例非糜烂型OLP作为实验组,3例健康对照者作为对照组。收集各组口内黏膜组织,通过中性蛋白酶消化法体外分离培养OLP原代角质形成细胞,免疫细胞化学法和形态观察法对培养的角质形成细胞进行鉴定。免疫荧光进一步检测mCRPs在细胞水平的表达。LPS（0,0.1,1,10,20μg/mL）刺激角质形成细胞HOK 24 h及48 h后,RT-qPCR检测CD46,CD55和CD59 mRNA的表达变化。结果:1.RT-qPCR结果显示,OLP组织中CD46,CD55和CD59 mRNA较正常对照组均显着下降（P<0.01）,但糜烂型与非糜型病例组间无明显差异（P>0.05）。Western blotting结果显示,糜烂型OLP组CD46和CD55蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,非糜烂型OLP组CD46和CD55蛋白表达水平较对照组无明显差异（P>0.05）。糜烂型及非糜烂型OLP组CD59蛋白表达与对照组相比均未见显着差异（P>0.05）。ELISA结果显示,OLP组血清中C3及sC5b-9含量较正常对照组无明显差异（P>0.05）,唾液中补体C3显着下降（P<0.05）,sC5b-9含量增高（P<0.05）。Pearson相关性分析显示,在糜烂型OLP中,唾液C3和REU评分呈负相关（r=-0.8098,P=0.0148）,余指标与REU评分未见明显相关性（P>0.05）。2.体外成功分离培养OLP原代角质形成细胞,形态学观察及角蛋白免疫细胞化学染色显示培养的细胞为单一的口腔角质形成细胞。免疫荧光染色显示,与正常对照组相比,OLP角质形成细胞中mCRPs表达均显着降低（P<0.01）。RT-qPCR结果显示,LPS刺激HOK 24 h后,CD46转录水平仅在20μg/mL浓度刺激时下降明显（P<0.05）,CD55和CD59表达水平在低浓度刺激下稍增高,20μg/mL刺激时稍降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。LPS刺激HOK细胞48 h后,CD46及CD59表达均明显降低（P<0.05）,CD55仅在0.1μg/mL浓度刺激下表达水平明显下降（P<0.05）。结论:1.OLP存在mCRPs表达水平降低及局部补体系统的异常激活。2.体外细胞实验进一步证实分离培养的OLP原代角质形成细胞存在mCRPs表达降低的现象。3.G-细菌毒力物质LPS刺激可使m CRPs表达下调,细胞更易受到补体攻击,可能与OLP上皮基底层细胞的凋亡有关。
孔昕欣[5]（2020）在《单中心25年儿童溶血尿毒综合征68例临床分析》文中指出背景与目的溶血尿毒综合征好发于儿童,起病急骤,进展极快,急性期死亡率高,且预后差,易反复,幸存者中仍有约25%-30%遗留永久肾损害。而目前国内外对溶血尿毒综合征（HUS）总群体特点和急性期血液学指标恢复情况的研究资料较少,为此本文研究目的是探讨HUS患儿的临床特点、急性期的治疗转归及其影响因素;并对比分析前13年（1994.5～2007.10）与近13年（2007.11～2019.9）治疗方案变化对急性期转归的影响。对象与方法回顾性分析山东大学附属省立医院于1994年5月至2019年9月期间收治的HUS患儿68例,总结其一般资料、临床表现、实验室检查、急性期的治疗与转归情况,并分析影响转归的可能危险因素与前后13年治疗方案变化对急性期转归的影响。结果1.一般资料:68例患儿中男女比例为5:2,年龄在0.08-13.5岁（中位数6.04岁）之间,发病季节全年散发,以5-8月、11-12月较为多见。2.临床表现（1）前驱感染:68例患儿中53例存在前驱感染症状,其中50例存在发热、咳嗽等呼吸系统症状,21例存在腹泻、血便等消化系统症状,16例存在联合感染症状。（2）急性期临床表现:68例患儿中,皮肤黏膜苍白、黄染47例;皮肤出血点或瘀斑42例;肉眼血尿43例,少尿或无尿31例,水肿27例,高血压26例;另有44例患儿出现肾外系统症状,如恶心、呕吐等消化系统症状,嗜睡、惊厥等神经系统症状。3.实验室检查（1）血尿常规及骨髓检查:急性期血常规示68例患儿均存在贫血,其中65例呈现中至重度贫血,61例网织红细胞升高,54例存在血小板减少症。尿液检查示39例患儿呈现大量蛋白尿水平。36例骨髓穿刺检查示溶血性贫血和血小板减少症。（2）生化化验:肝肾功能示68例均呈现急性肾损害;38例呈现高胆红素血症,以间接胆红素升高为主;52例呈现高乳酸脱氢酶血症。（3）免疫指标:37例补体C3降低、C4正常,9例补体C3、C4均降低。9例行H因子与ADAMTS13活性检查,ADAMTS13活性均正常,7例H因子抗体阳性,H因子浓度2例正常,5例降低。（4）影像学检查:41例行泌尿系统超声检查,主要表现出双肾实质回声增强;24例行胸部影像学检查,主要表现出肺炎、支气管炎或胸腔积液等;13例行颅脑MRI或CT检查,结果示9例可见脑内异常信号,2例表现为可逆性后部脑病。（5）肾穿刺活检:12例患儿行肾穿刺活检,光镜主要表现为系膜增生、内皮细胞肿胀、球囊粘连、基底膜双轮廓、弥漫性或节段性肾小球硬化、毛细血管微血栓、洋葱皮样改变等;免疫荧光均沿系膜区或毛细血管壁成颗粒状分布;电镜主要表现为肾小球内皮细胞肿胀,内皮下间隙增宽,弥漫性或节段性足突融合,肾小管上皮细胞肿胀等,结果均符合溶血尿毒综合征表现。（6）基因检测结果;6例患儿行基因检测,1例示CFHR5基因突变,1例示MMACHC基因突变,余4例患儿未检测到与疾病相关的变异。4.治疗与转归（1）治疗:2007年11月之前的28例HUS患儿在急性期缺乏特异性的治疗方案,仅给予抗感染、抗凝、利尿、降压和血液净化等一般对症支持治疗;2007年11月之后的40例HUS患儿开始采用个体化综合治疗方案,包括小剂量糖皮质激素、大剂量甲强龙冲击、环磷酰胺冲击以及丙种球蛋白等。（2）急性期治疗1个月时评价患儿转归情况:在2007年11月之前,治疗缓解率为28.57%（8/28）;未缓解率为42.86%（12/28）,包括死亡10例和病情加重2例;放弃治疗率为28.57%（8/28）。在2007年11月之后,治疗缓解率为77.5%（31/40）;未缓解率为10%（4/40）,包括死亡1例和病情加重3例;放弃治疗率为12.5%（5/40）。对比前后13年的恢复情况,采用个体化综合治疗方案后治疗缓解率明显提高（28.57%vs 77.5%）,未缓解率明显下降（42.86%vs 10%）。（3）转归影响因素分析:对急性期治疗1个月时的转归情况进行对比分析,发现治疗缓解组（39例）与未缓解组（16例）在发病年龄、发病天数、腹泻、血便、高血压、惊厥、神经系统症状、合并感染、血红蛋白、C反应蛋白、血沉、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、白蛋白、尿素氮、血肌酐、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、D-2聚体以及纤维蛋白原上均无统计学差异（P>0.05）;在少尿、补体C3及个体化综合治疗方案的使用上存在明显统计学差异（P<0.05）。（4）前后13年对比分析:在去除性别、发病年龄、腹泻、少尿、惊厥、高血压、血红蛋白、血小板、网织红细胞比率、补体C3、间接胆红素、尿素氮、血肌酐以及乳酸脱氢酶的影响下（P>0.05）,分析急性期治疗方案的变化对1个月时转归情况的影响,得出采用个体化综合治疗方案的近13年（2007.11～2019.9）阶段的治疗缓解率明显高于仅采用对症支持治疗的前13年（1994.5～2007.10）阶段,且差异具有统计学意义（P<0.05）。结论HUS患儿男孩多于女孩,以学龄前期与学龄期多见,发病季节全年散发,以夏冬季节多见。HUS患儿大多存在前驱感染症状,临床表现多样,且肾外系统损害常见。前后13年恢复情况对比,采用个体化综合治疗方案以后,治疗缓解率明显提高,未缓解率明显下降。通过统计学分析,得出伴有少尿、低补体C3血症可能是影响患儿急性期治疗1个月时转归情况差的危险因素,采用个体化综合治疗方案可以提高HUS患儿急性期1个月时的治疗缓解率。
刘小雪[6]（2019）在《半滑舌鳎皮肤免疫相关蛋白筛选鉴定及其基因表达研究》文中认为半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国重要的海水养殖品种,致病性弧菌感染导致其皮肤溃疡、腹水症等频繁发生。本研究以创伤弧菌（Vibrio vulnificus）感染半滑舌鳎为实验动物,通过同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ）技术对半滑舌鳎皮肤免疫相关蛋白筛选鉴定,并采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）技术对候选基因表达验证分析。结果表明,从感染诱导舌鳎皮肤i TRAQ蛋白测序数据中筛选获得23个免疫相关蛋白,主要包括补体（C3、C5、C8β、C9等）、凝血因子（F2、FX、FXIII）、热休克蛋白（HSPs）、α2巨球蛋白（A2ML）、黏蛋白（MUCs）及小清蛋白（PVβ）等,其中热休克蛋白Hsp71和小清蛋白PVβ等上调表达,而补体C3、C5、C9等下调表达;进一步采用qRT-PCR方法对皮肤差异蛋白基因mRNA时序表达分析。结果表明,补体C3、C5、C8β和C9在感染6 h均显着性上调表达,在12 h显着性下调表达,然后在24 h表达量最大;热休克蛋白Hsp71在感染6 h后上调表达,36 h表达量最高;凝血因子（F2）、肝素辅因子2（HCII）、小清蛋白（PVβ）、α2巨球蛋白（A2ML）均在24 h表达量最高。在感染12 h、36 h分别对i TRAQ筛选的差异表达蛋白验证分析,与qRT-PCR检测目的基因mRNA表达结果基本一致（r=0.746）。以半滑舌鳎皮肤cDNA为模板,采用RT-PCR方法扩增黏蛋白CsMUC18、CsMUC5AC、CsMLP等,并对蛋白结构、抗原表位以及系统发育树分析。结果表明,获得CsMUC18、CsMUC5AC和CsMLP基因片段分别为1934 bp、2771 bp和2989 bp,推测编码635 aa、917 aa、996 aa;预测CsMUC5AC、CsMLP分别含有5、6个主要抗原表位,均含有C8、VWD等结构域;CsMUC18含有7个主要抗原表位、免疫球蛋白超家族结构域等。系统发育树分析显示CsMUC5AC、CsMLP与分泌型黏蛋白亲缘关系最近,而CsMUC18与膜结合型黏蛋白亲缘关系最近。进一步对CsMLP基因的组织分布与时序表达分析,结果表明CsMLP在鳃、皮肤组织中丰富表达,在创伤弧菌感染12h显着性上调表达,在36 h显着性下调表达（p<0.01）。以上研究结果,为半滑舌鳎弧菌病的皮肤免疫应答机制及蛋白质组学提供科学参考。
姚青[7]（2017）在《CD46 IVS1-1724多态性与复发性流产的关系》文中认为目的:（1）探讨补体膜辅蛋白CD46基因IVS1-1724位点等位基因与复发性流产（Recurrentspontaneousabortion,RSA）的相关性;（2）探讨补体膜辅蛋白CD46基因IVS1-1724位点基因型与RSA的相关性;（3）对补体膜辅蛋白CD46基因位点及RSA的危险因素进行Logistic回归分析。方法:收集66例诊断为RSA的患者及118例正常妊娠孕妇作为研究对象,清晨空腹抽取静脉血,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测补体膜辅蛋白CD46基因IVS1-1724位点的等位基因,并分析其基因型。采用χ2检验或fisher精确检验比较基因型和等位基因的频率。采用Logistic回归分析对影响RSA的危险因素进行分析。结果:（1）观察组G等位基因比例明显高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）观察组GG基因型比例54.5%明显高于对照组28.8%,而CC基因型比例15.2%明显低于对照组35.6%,差异有统计学意义（P<0.05）;（3）观察组显性模型CC+GC基因型比例45.5%明显低于对照组71.2%,差异有统计学意义（P<0.05）;（4）观察组隐性模型GG+GC基因型比例84.8%明显高于对照组64.4%,差异有统计学意义（P<0.05）;（5）观察组中大于30岁、甲状腺功能低下、宫颈机能不全、纵膈子宫、先天子宫畸形、宫腔粘连、子宫肌瘤及IgG型抗心磷脂抗体阳性比例明显高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;（6）宫颈机能不全、先天子宫畸形、宫腔粘连及IgG型抗心磷脂抗体阳性及G等位基因、GG基因型、隐性模型（GG+GC）是RSA发生的危险因素（P<0.05）,显性模型CC+GC是RSA发生的保护因素（P<0.05）结论:（1）RSA患者CD46基因ivs1-1724C>GSNP位点G等位基因、GG基因型、隐性模型（GG+GC）比例明显高于健康妊娠孕妇,而显性模型（CC+GC）低于健康妊娠孕妇;（2）G等位基因、隐性模型（GG+GC）是RSA发生的危险因素,而显性模型（CC+GC）是RSA发生的保护因素。（3）临床上对上述含G等位基因、GG基因型及隐性模型（GG+GC）的妊娠孕妇需引起重视。
杨柳,谢红浪[8]（2016）在《非典型溶血尿毒综合征》文中研究表明近来研究证实非典型溶血尿毒综合征（a HUS）与多种补体成分、活化因子及调节因子基因突变密切相关,基因筛查有助于病因诊断、预测预后及肾移植结局。补体H因子相关蛋白融合基因产物是a HUS发病机制的最新研究热点,抗补体治疗能够有效控制a HUS进展、改善预后,依库珠单抗与血浆置换、免疫抑制治疗、器官移植已被纳入a HUS治疗指南。对于尚未进入终末期肾病的患者进行单独肝移植是否普遍推广有待于进一步探索。本文旨在对a HUS诊治的最新研究进展作一综述。
易翠莉[9]（2015）在《中国南方汉族非典型溶血尿毒综合征患儿补体基因突变分析》文中研究表明目的非典型溶血尿毒综合征（atypical hemolytic uremic syndrome,a HUS）患者的发病与补体基因突变导致补体系统旁路途径失调有关。不同补体基因突变的a HUS患者,对血浆治疗的反应、进展至终末期肾脏疾病率或死亡率、复发率及肾移植后复发率不同。3%～7%的a HUS患者同时存在两个或两个以上补体基因的联合突变,联合突变的a HUS患者预后与单个补体基因突变患者预后亦不同。因此,有必要对每一个a HUS患者进行所有补体基因的突变分析,根据突变基因进行个体化治疗。国外补体基因突变分析发现50%左右a HUS患者存在补体基因突变。但国内数个对a HUS患儿进行单个补体基突变分析的研究均未检测出致病突变,目前国内尚无对中国a HUS患儿进行所有补体基因突变分析的研究。为明确中国a HUS患儿补体基因突变情况及是否有必要对中国a HUS患儿进行所有补体基因的检测,本研究对11例中国南方汉族a HUS患儿进行10个补体基因（CFH、MCP、CFI、CFB、C3、CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5）突变分析。方法研究对象为11例中国南方汉族a HUS患儿,对照人群为千人基因计划（1000G）提供的正常人群。取所有研究对象外周静脉血3m L,提取基因组DNA。应用靶序列捕获测序的方法同时对11例a HUS患儿进行10个补体基因所有外显子及每个外显子5’端及3’端各25bp序列的捕获和测序。从测序结果中筛选出位于外显子/剪切位点的非同义变异/无义变异/意义不明的变异/小片段插入缺失,再进行数据库检索,选择已报道与a HUS发病有关的致病基因突变或基因多态性及在1000G数据库中等位基因频率小于1%或不存在于1000G数据库中的基因突变。对筛选出的基因突变及与a HUS发病有关的基因多态性应用PCR扩增和Sanger测序法一一进行验证。最后对验证确实存在的基因突变进行致病性分析,包括核苷酸及氨基酸保守性分析、氨基酸理化性质分析、蛋白质结构功能分析和功能预测软件致病性预测;对验证确实存在的基因多态性进行患者与正常对照等位基因频率的比较。结果应用靶序列捕获测序于11例a HUS患儿的10个补体基因中共检测出53个基因变异,经筛选、验证及致病性分析,于3例a HUS患儿中检测到两个致病突变,CFB 221G>A（R74H）及CFHR5 242C>T（P81L）,其中CFHR5 242C>T（P81L）为一个新发现突变。11例中国南方汉族a HUS患儿补体基因突变检出率为27.3%（3/11）,其中CFB基因突变率为18.2%（2/11）,CFHR5基因突变率9.1%（1/11）。此外,在9例a HUS患儿中检测出1个已经报道与a HUS发病有关的基因多态性CFH 2808G>T,经患儿与健康对照间等位基因频率比较,此基因多态性与中国a HUS患儿的发病无关联。结论中国南方汉族a HUS患儿存在补体基因突变,提示需对中国南方汉族a HUS患儿进行补体基因突变分析,而且必须进行所有已知致病补体基因的突变分析。
刘栋[10]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中研究说明在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
二、补体膜辅蛋白的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、补体膜辅蛋白的研究进展（论文提纲范文）
（1）Hcy、hs-CRP及LDLC联合检测对冠心病的诊断价值（论文提纲范文）
| 1 资料和方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 病例选择标准 |
| 1.3 Hcy、hs-CRP及LDLC检测 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 各组基线资料比较 |
| 2.2 两组血清Hcy、hs-CRP和LDLC水平比较 |
| 2.3 CHD各亚组血清Hcy、hs-CRP和LDLC水平比较 |
| 2.4 二元Logistic回归分析 |
| 2.5 Hcy、hs-CRP和LDLC及3者联合诊断CHD |
| 2.6 心肌酶谱对CHD的诊断价值 |
| 3 讨 论 |
（2）血清补体因子及补体调节蛋白与DKD的相关性研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 补体系统撖活在DKD中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）膜锚定补体调节蛋白CD46，CD55和CD59在口腔扁平苔藓中表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 mCRPs在口腔扁平苔藓局部病变组织中的表达 |
| 材料与方法 |
| 1.研究对象 |
| 1.1 研究对象来源 |
| 1.2 纳入标准与排除标准 |
| 1.3 REU评分 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 实验仪器设备 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 样本收集 |
| 3.2 HE染色 |
| 3.3 RT-qPCR检测OLP病变组织中mCRPs mRNA的表达 |
| 3.4 Western Blotting检测OLP病变组织中mCRPs蛋白的表达 |
| 3.5 ELISA检测唾液及血液中补体C3及s C5b-9 的含量 |
| 3.6 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 体外实验验证mCRPs促进OLP发展的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 实验仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 OLP角质形成细胞的分离与培养 |
| 2.2 OLP角质形成细胞的传代 |
| 2.3 OLP角质形成细胞的鉴定 |
| 2.4 免疫荧光检测mCRPs在 OLP角质形成细胞中的表达 |
| 2.5 RT-qPCR检测LPS刺激前后mCRPs转录水平的变化 |
| 2.6 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表（附录） |
| 致谢 |
（5）单中心25年儿童溶血尿毒综合征68例临床分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1. 研究对象与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 疗效评价标准 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 临床表现 |
| 2.2.1 前驱感染 |
| 2.2.2 急性期临床表现 |
| 2.3 实验室检查 |
| 2.3.1 血尿常规及骨髓检查 |
| 2.3.2 生化化验 |
| 2.3.3 免疫指标 |
| 2.3.4 影像学检查 |
| 2.3.5 肾脏病理特点 |
| 2.3.6 基因检测 |
| 2.4 治疗与转归 |
| 2.4.1 治疗 |
| 2.4.2 转归 |
| 2.4.3 转归影响因素分析 |
| 2.4.4 前后13年对比分析 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 溶血尿毒综合征的病因、治疗与预后相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）半滑舌鳎皮肤免疫相关蛋白筛选鉴定及其基因表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鱼类皮肤抗菌因子的研究进展 |
| 1.2 补体系统的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 半滑舌鳎皮肤免疫相关蛋白的筛选及其基因表达验证分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 半滑舌鳎皮肤黏蛋白基因克隆、组织分布与时序表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位论文期间发表的论文 |
（7）CD46 IVS1-1724多态性与复发性流产的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 观察组 |
| 1.2 对照组 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 SNP位点选择 |
| 2.3 生物样品的测定 |
| 2.4 DNA样本获得 |
| 2.5 补体膜辅蛋白C D46基因引物设计 |
| 2.6 采用HindⅢ限制性内切酶进行酶切 |
| 2.7 质量控制 |
| 2.8 统计方法 |
| 研究结果 |
| G位点酶切结果'>1 CD46基因ivs1-1724 C>G位点酶切结果 |
| 2 Hardy-Weinberg平衡检验 |
| G位点等位基因分布'>3 CD46基因ivs1-1724 C>G位点等位基因分布 |
| G位点基因型分布'>4 CD46基因ivs1-1724 C>G位点基因型分布 |
| G位点显性模型分析'>5 CD46基因ivs1-1724 C>G位点显性模型分析 |
| G位点隐性模型分析'>6 CD46基因ivs1-1724 C>G位点隐性模型分析 |
| 7 两组受试者基本资料比较 |
| G位点多因素Logistic回归分析'>8 CD46基因ivs 1-1724 C>G位点多因素Logistic回归分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
（8）非典型溶血尿毒综合征（论文提纲范文）
| 病因 |
| 诊断 |
| 治疗 |
| 免疫抑制剂 |
| 器官移植 |
| 补体调节 |
| 小结 |
（9）中国南方汉族非典型溶血尿毒综合征患儿补体基因突变分析（论文提纲范文）
| 附录 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本收集 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂及配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 基因组DNA获得 |
| 2.1.1 基因组DNA提取 |
| 2.1.2 基因组DNA定量 |
| 2.2 靶序列捕获测序 |
| 2.2.1 DNA质检 |
| 2.2.2 靶序列捕获探针的设计及合成 |
| 2.2.3 靶序列测序(此步骤主要与上海伯豪生物技术有限公司合作进行) |
| 2.3 靶序列捕获测序基因变异的筛选 |
| 2.4 靶序列捕获测序的验证 |
| 2.4.1 靶序列捕获测序敏感性验证 |
| 2.4.2 靶序列捕获测序特异性验证 |
| 2.5 基因突变的致病性分析 |
| 2.5.1 核苷酸保守性分析 |
| 2.5.2 氨基酸保守性分析 |
| 2.5.3 氨基酸理化性质分析 |
| 2.5.4 蛋白质的结构功能分析 |
| 2.5.5 功能预测软件对基因突变的致病性预测 |
| 2.6 基因多态性在患儿与正常人群中等位基因频率的比较 |
| 2.7 统计方法 |
| 结果 |
| 1.11例a HUS患儿的临床资料 |
| 2.靶序列捕获测序结果 |
| 2.1 DNA质检结果 |
| 2.2 靶序列捕获结果 |
| 2.3 靶序列测序结果 |
| 3.基因变异筛选结果 |
| 4.靶序列捕获测序验证结果 |
| 4.1 靶序列捕获测序敏感性 |
| 4.2 靶序列捕获测序特异性 |
| 5.基因突变的致病性分析 |
| A(R74H)致病性分析'>5.1 突变CFB221G>A(R74H)致病性分析 |
| T(P81L)致病性分析'>5.2 突变CFHR5 242C>T(P81L)致病性分析 |
| T 在 11 例 a HUS 患儿与正常人群中等位基因频率的比较'>6. CFH 基因 SNP2808G>T 在 11 例 a HUS 患儿与正常人群中等位基因频率的比较 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 补体旁路失调非典型溶血尿毒综合征的个体化治疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
四、补体膜辅蛋白的研究进展（论文参考文献）
- [1]Hcy、hs-CRP及LDLC联合检测对冠心病的诊断价值[J]. 舒银珍,全晖,曾志荣. 中南医学科学杂志, 2022(01)
- [2]血清补体因子及补体调节蛋白与DKD的相关性研究[D]. 李玉凤. 昆明医科大学, 2021(01)
- [3]补体在肾小球疾病精准医疗中的临床意义[J]. 杨阳,苗留飞,李晓军. 中华检验医学杂志, 2020(09)
- [4]膜锚定补体调节蛋白CD46，CD55和CD59在口腔扁平苔藓中表达的研究[D]. 李璐璐. 青岛大学, 2020(01)
- [5]单中心25年儿童溶血尿毒综合征68例临床分析[D]. 孔昕欣. 山东大学, 2020(02)
- [6]半滑舌鳎皮肤免疫相关蛋白筛选鉴定及其基因表达研究[D]. 刘小雪. 天津农学院, 2019(08)
- [7]CD46 IVS1-1724多态性与复发性流产的关系[D]. 姚青. 苏州大学, 2017(07)
- [8]非典型溶血尿毒综合征[J]. 杨柳,谢红浪. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2016(01)
- [9]中国南方汉族非典型溶血尿毒综合征患儿补体基因突变分析[D]. 易翠莉. 福建医科大学, 2015(07)
- [10]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)