一、一种肝细胞联合冷冻保存的新方法（论文文献综述）
冯天雨[1]（2021）在《白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响》文中进行了进一步梳理精原干细胞（SSCs）位于雄性动物睾丸曲细精管的基底膜,是唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。SSCs既能自我更新以维持干细胞池的稳定,又能分化参与精子发生,因而SSCs的研究对于了解雄性生殖细胞的分化机制具有重要意义,并且在转基因动物生产和男性不育症治疗方面具有临床应用价值。细胞的冷冻保存能够保持细胞的生物学特性并保障细胞的长期供应,而SSCs冷冻保存是保存优质未成熟雄性奶山羊生殖能力的重要方法。但是,冷冻-解冻过程会增加细胞内活性氧（ROS）的产生,引起SSCs氧化应激,并导致细胞凋亡,降低冻后细胞活力,因而SSCs冷冻保存过程中所受的氧化损伤是一个亟待解决的问题。白藜芦醇是一种天然植物多酚类化合物,具有广泛的生物和药理活性,包括抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、神经保护、心血管疾病防治等作用。目前对于家畜SSCs冷冻保存的研究较少,且尚未有白藜芦醇对SSCs冷冻保存效果方面的研究报道。因此,本研究首先对不同年龄奶山羊的睾丸进行切片观察和蛋白检测,以确定SSCs的表达情况,再通过两步酶消化和差速贴壁从奶山羊睾丸分离和纯化SSCs;其次用含有不同浓度白藜芦醇的冷冻保存液重悬SSCs并利用液氮进行超低温冷冻保存,解冻后检测SSCs活力,筛选最适白藜芦醇浓度;最后通过试剂盒检测、流式细胞术、Western blot、透射电镜等方法探究冷冻-解冻细胞的抗氧化、抗凋亡以及AMPK激活情况,初步揭示白藜芦醇对奶山羊SSCs冷冻保存的保护机制。本试验主要研究结果如下:1.通过不同月龄（15日龄、1月龄、3月龄、6月龄、10月龄）奶山羊睾丸的苏木精-伊红（HE）染色和PGP9.5免疫组织化学染色观察发现,随着奶山羊年龄的增长,曲细精管直径变大,睾丸细胞种类增加,精原细胞总量增多但所占比例下降。Western blot检测不同日龄（15、30、45、60、75、90、180日龄）奶山羊睾丸中PGP9.5和THY1的蛋白表达量显示,60日龄前的奶山羊睾丸中精原细胞含量显着高于75日龄后（P<0.05）,适合用于提取SSCs。2.通过机械分离和两步酶消化分离睾丸细胞,再经差速贴壁纯化收集奶山羊SSCs。利用免疫荧光染色对细胞进行鉴定显示,纯化后的细胞高表达分子标记GFRα1、PLZF、PGP9.5和THY1,表示本研究方法可获得纯度较高的SSCs。3.在冷冻保存液中添加不同浓度（0、0.1、1、10、100μmol/L）白藜芦醇,使用缓慢冷冻法保存奶山羊SSCs,37℃解冻后对细胞的活力和抗氧化能力进行测定。利用CCK-8和台盼蓝染色检测SSCs活力,结果显示当白藜芦醇浓度为10μmol/L时冻后细胞活力显着高于对照组和其他试验组（P<0.05）。与对照组相比较,冷冻保存液中添加白藜芦醇显着提高了冷冻-解冻后SSCs的总抗氧化能力（T-AOC）、线粒体膜电位和抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）活性（P<0.05）,同时显着降低了细胞内ROS水平和丙二醛（MDA）含量（P<0.05）,其中10μmol/L白藜芦醇组SSCs的抗氧化效果显着优于其他试验组（P<0.05）,而ROS水平和MDA含量与100μmol/L组差异不显着（P>0.05）。4.选取对照组和10μmol/L白藜芦醇处理组进一步探究白藜芦醇在冷冻-解冻过程中保护SSCs的机制。Annexin V-FITC流式细胞检测结果表明,白藜芦醇组中SSCs的凋亡比例显着低于对照组（P<0.05）。白藜芦醇可极显着抑制促凋亡蛋白Bax的表达并促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（P<0.01）;抑制细胞色素C从线粒体释放至细胞质,从而减少caspase 3和caspase 9的表达（P<0.05）。此外,白藜芦醇可激活细胞AMPK磷酸化,且此种作用可被AMPK抑制剂Compound C部分抵消。透射电镜对细胞超微结构的观察结果显示,冷冻保存液中白藜芦醇的添加显着降低了冷冻-解冻后SSCs的线粒体肿胀空泡化、膜起泡以及核变的比例（P<0.05）。以上研究结果表明,冷冻保存液中添加白藜芦醇能够有效提高冷冻-解冻后奶山羊SSCs的质量,且其最适浓度为10μmol/L。白藜芦醇通过提高细胞抗氧化能力,抑制线粒体途径凋亡,并且激活生物能量代谢调节关键因子AMPK磷酸化,从而在冷冻-解冻过程中减少损伤,发挥保护SSCs的作用。
王永娟[2]（2021）在《LR12在TAA诱导的急性肝衰竭中的治疗作用及机制研究》文中研究说明急性肝衰竭（ALF）是一种罕见而严重的疾病,威胁着人类的健康。肝移植是治疗ALF最有效的方法。然而,由于供体器官缺乏、价格高昂等因素导致肝移植应用受限。因此,寻找治疗ALF的新方法迫在眉睫。肝细胞坏死导致肝脏募集大量的炎症细胞,进而引发全身炎症反应综合征（SIRS）为ALF的病理机制之一。因此,抑制炎症反应是治疗ALF的关键。小分子多肽LR12能够抑制髓样细胞表达触发受体1（TREM-1）的激活,对多种炎症疾病具有治疗作用。然而,LR12在ALF中的作用尚不清楚。肝再生不足以代偿肝细胞坏死,导致肝功能缺失,进而引发多器官功能衰竭是ALF的病理机制之一。肝脏是一个具有强大再生能力和显着调节最终质量能力的器官。以往的研究表明,肝再生是ALF存活的关键因素。然而,LR12是否能够促进肝再生尚不清楚。本研究建立了TAA诱导的ALF小鼠模型,观察LR12对ALF小鼠肝脏损伤的作用及肝再生的作用;通过体外建立TAA诱导的肝细胞损伤模型,探讨LR12促进肝细胞再生的机制;本研究通过细胞因子芯片技术筛选出LR12作用于巨噬细胞促进肝再生的关键因子,并通过体外和体内实验进一步验证。本课题主要包括以下四部分:第一部分LR12减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生目的:本研究旨在建立硫代乙酰胺（TAA）诱导的ALF小鼠模型,观察LR12对ALF的治疗作用。方法:1.腹腔注射TAA建立ALF小鼠模型。实验分组:对照组、TAA组、LR12组及TAA+LR12组。2.苏木素-伊红（H&E）染色检测肝脏病理变化。赖氏法检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的含量。3.观察TAA组和TAA+LR12组小鼠的存活率。4.Western blot方法检测小鼠肝脏中PCNA的表达。5.激光共聚焦（CLSM）方法检测小鼠肝脏中肝细胞标志角蛋白18（CK18）与增殖指标增殖细胞核抗原（PCNA）的共定位及表达情况。结果:1.造模后,TAA组小鼠肝脏可见肝细胞出血性坏死,而TAA+LR12组肝细胞出血性坏死面积减少（P<0.001）。2.TAA组ALT、AST水平较对照组显着升高,而TAA+LR12组ALT、AST水平较TAA组显着降低（P<0.01）。3.TAA+LR12组小鼠存活率显着高于TAA组（P<0.05）。4.TAA+LR12组小鼠肝脏中PCNA蛋白表达量较TAA组上调（P<0.01）。5.与TAA组相比,TAA+LR12组小鼠肝脏中CK18与PCNA共定位的细胞数显着增多（P<0.001）。结论:LR12能够减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生。第二部分:LR12通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖目的:本研究旨在建立TAA诱导的肝细胞损伤模型,研究LR12促进肝细胞再生的机制。方法:1.建立不同浓度TAA诱导的LO2细胞损伤模型,Western blot方法检测PCNA的表达。2.应用TAA或联合LR12刺激LO2细胞,CLSM和Western blot方法检测PCNA的表达。3.应用TAA或联合LR12刺激巨噬细胞后的上清液刺激LO2细胞或原代肝细胞,CLSM和Western blot方法检测PCNA的表达。4.流式细胞术（FCM）检测LO2细胞的细胞周期。结果:1.1 mM TAA组、2 mM TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低（P<0.05）。2.TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低,而TAA+LR12组PCNA蛋白表达量较TAA组无显着变化（P>0.05）。3.Supernatant-TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组PCNA蛋白表达量较Supernatant-TAA组显着升高（P<0.01）。原代肝细胞的结果与LO2细胞的结果一致。4.Supernatant-TAA组LO2细胞S期细胞比例较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组S期细胞比例较Supernatant-TAA组显着增多（P<0.01）。结论:LR12通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖。第三部分:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生目的:本研究旨在探讨LR12作用于巨噬细胞促进肝细胞再生的机制。方法:1.应用细胞因子芯片技术筛选TAA或联合LR12刺激巨噬细胞上清液中与增殖相关的细胞因子。2.酶联免疫吸附实验（ELISA）方法及实时荧光定量聚合酶链反应（q-RT-PCR）方法检测C-C趋化因子配体20（CCL20）的表达。3.建立TAA诱导的ALF小鼠模型,CLSM方法检测巨噬细胞标志F4/80与CCL20的共定位及表达情况。4.将LO2细胞分为对照组,TAA组,CCL20组及TAA+CCL20组,Western blot方法检测PCNA的表达。5.将LO2细胞分为Supernatant-TAA+LR12组和Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组,Western blot方法检测PCNA的表达。6.将小鼠分为TAA+LR12+Ig G组和TAA+LR12+anti-CCL20组,H&E染色检测肝脏病理变化。7.赖氏法检测血清ALT、AST的含量。8.CLSM方法检测小鼠肝脏中肝细胞标志CK18与PCNA的共定位及表达情况。结果:1.Supernatant-TAA组巨噬细胞上清液中CCL20蛋白表达量较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组CCL20蛋白表达量较Supernatant-TAA组显着升高（P<0.05）。2.ELSA及PCR结果与芯片结果一致。3.与TAA组相比,TAA+LR12组小鼠肝脏中F4/80与CCL20共定位细胞数显着升高（P<0.001）。4.TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低,而TAA+CCL20组PCNA蛋白表达量较TAA组显着升高（P<0.01）。5.与Supernatant-TAA+LR12组相比,Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组LO2细胞中PCNA蛋白表达量显着降低（P<0.01）。6.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠肝细胞出血性坏死面积显着增加（P<0.001）。7.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠ALT、AST水平显着升高（P<0.05）。8.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠肝脏中CK18与PCNA共定位的细胞数显着减少（P<0.001）。结论:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生。第四部分:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生目的:本研究旨在阐明LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20调控肝细胞再生的机制。方法:1.应用TAA或联合LR12刺激巨噬细胞后的上清液刺激LO2细胞,Western blot方法检测LO2细胞中p-p38的表达。2.建立TAA诱导的ALF小鼠模型,提取原代肝细胞,Western blot方法检测原代肝细胞中p-p38的表达。3.将LO2细胞分为Supernatant-TAA+LR12组和Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组,Western blot方法检测LO2细胞中p-p38的表达。4.将小鼠分为TAA+LR12+Ig G组和TAA+LR12+anti-CCL20组,CLSM方法检测肝细胞中p38的核转位情况。结果:1.Supernatant-TAA组LO2细胞中p-p38蛋白表达量较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组p-p38蛋白表达量较Supernatant-TAA组显着升高（P<0.01）。2.TAA+LR12组小鼠原代肝细胞中的p-p38蛋白表达量较TAA组显着上调（P<0.05）。3.与Supernatant-TAA+LR12组相比,Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组LO2细胞中p-p38蛋白表达量显着下调（P<0.001）。4.与TAA+LR12+anti-CCL20组相比,TAA+LR12+Ig G组小鼠可见肝细胞中p38核转位。结论:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生。
马红[3]（2021）在《二肽基肽酶-Ⅳ检测新方法的建立及其在大鼠脏器损伤评价中的比较性研究》文中提出脏器损伤及其专属性评判是临床中最基本、也是最重要的诊断与评判。以药物性脏器损伤为例,临床中及时发现相关的药物不良反应和毒副作用,对新药物研发和临床诊断与治疗都是十分重要的。但由于药物使用往往在诊断之后,因此鉴别损伤的因果关系或原始性损伤部位常常面临着巨大的挑战。药物性脏器损伤（Drug-induced organ injury）也被称为异物质性脏器损伤,很难与其它病原性损伤相区分。而且药物性脏器损伤同样呈现出明显的炎性损伤特征,这种特征具有明显的“损伤相关分子模式（Damage Associated Molecular Patterns,DAMPs）”。以药物性肝脏损伤为例,损伤通常有三大类:1、异物质对组织细胞的直接损伤事件;2、直接损伤后内源性代谢物的积累与蓄积,如胆汁酸,胆红素,这些内源物成为继发性细胞损伤性中间关键事件;3、由于细胞破坏所形成内源性物质或内外源性因素共同诱发体内炎性反应事件,形成免疫系统的“二次打击”,逐渐形成非感染性的脏器炎性伤害结局。整个损伤过程就是二次或多次打击的重复。由于DAMPs混杂的机制与模式,肝损伤呈现出两大特征:1、起始于非感染性炎性因素,前期是直接损伤,后期是炎性损伤,一旦进入重复或多次打击程度,其损伤特征很难回到初期的直接打击特征,表现位混合机制的多次打击特征;2、从整体上看,损伤呈现出异质性或非均匀性或非同步性,造成种属间、个体间、脏器间、细胞间的损伤差异,使损伤原因难以判定,组织的损伤专属性也难以判定。继而,损伤的判定标准因其准确性、敏感性及特异性的差异失去把控。在脏器损伤评价中,在没有明确的药物-药效因果关系,损伤评判便很难找到“药物性”的特征。药物性脏器损伤的脏器专属性评判方法包括组织病理学诊断和标志物定量分析,前者是通过组织来判定的,被视为诊断金标准,后者是评估从损伤细胞释放到体液中的某种标志物来间接推定源头组织的损伤程度。因此,标志物是否来源于某个组织,其在组织内的丰度与组织内该标志物的残余活性、以及体液中的标志物的变化关系都需要验证。同时,组织病理学诊断这一金标准也面临着诸多挑战。它是一种定性、描述性分析方法,具有主观性和客观性局限性,样本采集、医生诊断经验与偏好都会影响诊断结果。而损伤标志物因其简单明确、高选择性与可定量性等检测优势,在临床诊断中得到广泛应用。但是,组织是多特征的,而不同的标志物有各自的特征,因此,标志物缺少多特征的特异代表性,强调某一特征的特异性既是标志物的优点也是其缺点。由于在不同个体、脏器、细胞间,标志物相对分布与丰度不同,导致诊断方法的效率与标准也不同。药物损伤往往是多元特征和多机制的,血清中的某一标志物是否源于某一损伤组织除需要该组织高丰度的标志物,还应使用其它组织高丰度标志来同时加以验证。我们设想利用肝脏以外高丰度标志物结合肝脏特异性标志物进行组合,以组织形态学为比照基准,对组织样本中某一特征标志物的含量或活性进行标定,建立具有形态学多元特质的多标志物组合定量分析方法,在保证某一形态学特征或特异性存在的基础上,通过多机制标志物的组合来克服组织形态学在定量分析上的劣势,发挥其病变评判多元特异性判断上的优势,从总体上,可改善现行“金标准”的综合诊断性能。二肽基肽酶-Ⅳ（Dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ）是一种体内多组织广泛分布的肽类水解酶,特异性水解位于肽链N端第二位置的丙氨酸或脯氨酸。体内多种活性肽类经DPP-Ⅳ水解后激活或者失活,因此,DPP-Ⅳ在体内具有多样化的病理生理机制、参与多种代谢过程,发挥着重要的调节功能。DPP-Ⅳ作为药物靶点也已有大量研究,除了作为2型糖尿病的靶点以外,也是很多癌症治疗的靶点。DPP-Ⅳ在肾脏、肠中高表达,此外于肝脏、胰腺、胎盘、胸腺等也有表达,部分以可溶形式存在于循环血液中。可溶性DPP-Ⅳ（soluble DPP-Ⅳ,s DPP-Ⅳ）仍然具有水解酶活性,是潜在的脏器损伤或验证的标志物,已受到广泛关注。因此,利用酶活性检测方法定量检测不同组织部位DPP-Ⅳ的活性,进而验证脏器损伤程度。针对以上问题,本研究展开以下工作:1、首要任务是建立特异性高、灵敏度高的DPP-Ⅳ检测方法,对正常情形下不同组织中分布的DPP-Ⅳ进行特异性活性检测,将其作为一个有效的标志物,观察正常组织的成分组成的异质性;2、以此为基础,建立标志物组织残余活性测定方法,与组织形态学评分、血清DPP-Ⅳ水平和其它标志物的变化进行比较,分析并确认血液中标志物的组织来源;3、利用两种公认的肝脏专属性化学损伤剂（ANIT和CCl4）造模,诱导大鼠发生药物性肝损伤,比较造模前后大鼠体内多种组织DPP-Ⅳ残余总活性、组织DPP-Ⅳ酶比活性、血清DPP-Ⅳ酶比活性、血清DPP-Ⅳ总活性、肝脏组织病理形态学评分、传统肝损伤标志物的血清活性及其在肝脏的组织残余活性等指标的差异,验证两种造模剂脏器损伤专属性;4、为考察大鼠肝脏不同部位的损伤程度,我们将大鼠肝脏分为四部分,分别是A叶（左大叶）、B叶（中叶）、C叶（尾状叶）和D叶（左内叶、右叶、乳头叶和乳突叶的合并样本）。比较两种药物性肝脏损伤模型中不同肝叶或取材部位间各种DPP-Ⅳ活性的异质性变化,观察因肝脏异质性导致的损伤评判结果的变化,比较血清样本与组织样本间DPP-Ⅳ活性的差异。主要研究结果如下:1、基于新探针GP-BAN经DPP-Ⅳ水解作用后将生成BAN可产生荧光,我们建立了HPLC-FD检测法。该方法的线性度、灵敏度、回收率、精密度和稳定性均得到了充分验证。其定量下限为5n M（仅需2μL）,是目前灵敏度最高的方法。方差小于15%。用不同类型单酶及特异性抑制剂证明了该探针的DPP-Ⅳ特异性,进而保证了此种DPP-Ⅳ活性检测方法可用于组织微粒体、细胞匀浆、细胞上清、血液及单酶等多体系中的DPP-Ⅳ活性的定量检测,建立了DPP-Ⅳ组织残余活性检测方法。2、DPP-Ⅳ在正常大鼠体内肾、肠、脾脏组织中呈现高活性水平的丰度,而在肝脏组织中呈现较低水平,两者相差近百倍;不同肝叶组织的DPP-Ⅳ比活性及由该部位推算的总组织活性间存在差异;3、两种肝脏损伤剂（ANIT和CCl4）均可造成血清中DPP-Ⅳ活性明显升高,说明DPP-Ⅳ是一个具有非常好的损伤区分能力的标志物;通过组织残余活性测试,我们可以基本确认s DPP-Ⅳ并非来源于肝脏,很可能是因脾脏损伤或增殖而升高。4、检测了两种肝脏损伤模型中,ANIT造成较轻的直接损伤,其中A叶取材点的DPP-Ⅳ比活性及由取材点推算的DPP-Ⅳ总肝脏活性在损伤前变异度过大,其它各叶取材点在损伤后变异度过大,造成DPP-Ⅳ活性（比活性及总活性）升降均不具有统计学意义。利用肝灌流清洗祛除实体组织中残留可溶性DPP-Ⅳ,发现ANIT致大鼠肝损伤后DPP-Ⅳ比活性升高。5、模式肝毒剂CCl4造成更明显的肝脏直接损伤,但肾脏与小肠没有变化;在肝脏内部,部分肝叶取材部位的DPP-Ⅳ比活性及由该部位推算的总组织活性在损伤前后有统计学意义的变化;CCl4同时造成脾脏DPP-Ⅳ比活性的升高与总活性下降的相矛盾趋势,虽然该数据没有统计学差异,疑似CCl4诱导免疫系统的抑制趋势,但该推断需要进一步实验证实。结论:本研究中,我们建立了DPP-Ⅳ的高灵敏度检测方法;建立了血清及组织DPP-Ⅳ残余活性测定方法;在两种公认的大鼠肝脏损伤模型中,我们发现DPP-Ⅳ对两种损伤在血清样本检测中均有非常好的损伤区分力;结合肝脏组织残余活性检测,我们发现两种大鼠肝损伤模型在损伤前后DPP-Ⅳ及传统标志物活性水平均有较高异质性,两种损伤剂的损伤类型与机理不同。DPP-Ⅳ残余活性测定也可以作为重要的脏器异质性有效判定方法,同时也是一种肝外组织是否发生损伤的反验证标志物,可甄别肝外其它组织损伤或损伤的“二次打击”或“重复性打击”是否开启的有效标志物。组织残余活性虽然因取样具有临床局限性,但该方法在基础研究中应用前景非常广泛,它对确立一种组织专属性的标志物向临床转化起关键作用。
郜磊[4]（2020）在《两性离子分子甜菜碱在间充质干细胞冷冻保存中的应用研究》文中进行了进一步梳理间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有自我更新,多向分化以及免疫调节等特性,在修复组织损伤、治疗癌症等疾病方面具有广泛的应用前景。超低温冻存是长期保存MSCs的有效方法。在冻存保护剂（cryoprotectant,CPA）的保护下,冷冻至超低温环境（<-150℃）的细胞会停止新陈代谢,达到“休眠”状态,进而长期维持生物活性。当前,二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）是冻存MSCs常用的CPA,但其具有细胞毒性,会影响MSCs的正常功能。此外,移植DMSO冻存的MSCs会诱发病人产生过敏、心率失常、器官衰竭等副反应。因此,开发生物相容性好、冻存效率高的CPA,代替DMSO冻存MSCs具有重要意义。本研究使用两性离子分子甜菜碱结合可逆电穿孔技术实现了无DMSO化的MSCs高效保存。具体研究内容如下:本文首先测试了甜菜碱抑制冰晶形成的能力。结果表明,甜菜碱可以增加溶液中非冻结水含量,降低溶液的冰点,有望减少细胞受到的冰晶损伤。渗透压平衡实验表明,甜菜碱可以保护细胞免受氯化钠模拟的高渗环境造成的渗透压损伤,这可能是由于甜菜碱可以通过细胞膜上的转运载体进入细胞,进而平衡细胞内外渗透压。抗氧化实验证明了甜菜碱能够抑制活性氧的产生,并清除部分氧化自由基,具备抗氧化特性。细胞毒性实验表明,在不同浓度（2%～10%）、不同孵育温度（4或37℃）和不同孵育时间（0.5、1、12或24 h）条件下,甜菜碱均表现出了良好的生物相容性。相比之下,DMSO会显着降低细胞的存活率,具有明显的细胞毒性。基于以上甜菜碱良好的冻存保护特性和生物相容性,本文对甜菜碱的冷冻保存效果进行了测试,结果表明,单独使用甜菜碱作为CPA,无法有效冻存MSCs。在冻存前,将MSCs与甜菜碱共孵育4 h,复苏后细胞的存活率可提高至50%。进一步结合可逆电穿孔技术,复苏后细胞的存活率可提高至85%,且多项体外功能均未发生改变。这是由于电穿孔后细胞膜上会形成暂时性的亲水性孔,非特异性地提高MSCs的通透性,促进甜菜碱进入细胞,提升甜菜碱对细胞的保护效果。MSCs的体内归巢分布与细胞治疗的效果紧密相关。本文利用慢病毒转染和流式细胞分选技术构建了稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和萤火虫荧光素酶（firefly luciferase,Fluc）的UCMSCs（GFP-Fluc-UCMSCs）。结果表明,甜菜碱结合可逆电穿孔技术可高效冻存GFP-Fluc-UCMSCs。生物发光成像结果表明该保存技术不会影响GFP-Fluc-MSCs的体内归巢分布特性,有望推进无DMSO化冻存细胞的临床应用。
张玉林[5]（2020）在《人羊膜上皮细胞修复大鼠卵巢功能不全的实验研究》文中研究指明每年全球范围内有多达百万女性罹患癌症,其中大约10%的女性患者在育龄期。化学治疗的应用使癌症患者的生存率明显提高,约90%年轻的早期癌症患者在治疗后可以存活,但是化学治疗引起的远期并发症的风险却不可忽视。其中,最突出的远期影响包括因为化学治疗所引起的原发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency,POI）或卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）所致的早绝经和不育,极大地影响育龄期患者的生存质量。因此,在不妨碍癌症治疗的原则上,提高此类患者的生存质量、保护卵巢功能和生育力已经成为临床上医生与患者共同面临的难题。基础实验及临床病例表明,在杀灭癌症细胞的同时,许多化学治疗药物可以不同程度地损伤卵巢功能、使卵巢结构紊乱、卵巢纤维化明显、影响卵泡的启动、生长发育及成熟过程,但其具体机制仍不十分清楚。目前,临床上预防或者治疗化疗相关卵巢功能不全主要的方法有:促性腺激素释放激素类似物治疗、性激素替代治疗及生育力冷冻保存技术。促性腺激素释放激素类似物治疗预防化疗引起的卵巢功能不全目前只在乳腺癌中观察到有一定效果;性激素替代治疗只能改善患者的围绝经期症状,不能改善卵巢功能及生育能力;而生育力冷冻保存技术受到患者年龄、身体状态及婚姻状态等的制约,因此每种方法都有其局限性,尚不能广泛应用于临床。随着再生医学的兴起及发展,干细胞已经在多种疾病中证实有组织修复及组织再生的作用。目前,多个研究表明,干细胞移植在改善卵巢功能、修复卵巢组织结构及促进生育力方面具有一定的作用,但其机制仍不清楚。近年来,人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells,h AECs）的发现及研究为再生医学领域指引了新的研究方向。由于羊膜为医疗废物、来源丰富、获取简单、无道德伦理的制约,且h AECs具有一定干细胞特性、免疫原性低且未发现致瘤性,因此h AECs在再生医学领域具有广阔的应用前景,有望成为修复化疗所致卵巢功能不全的新方法。据报道,h AECs可以分泌多种细胞因子,这些细胞因子可能参与增殖、免疫调节、细胞凋亡和血管生成过程,并可以通过静脉移植、原位注射或腹腔注射h AECs或h AECs条件培养基改善卵巢功能,但其具体机制仍不十分清楚。第一部分 hAECs的原代细胞提取及生物学特性目的提取h AECs并培养、鉴定,为后续实验提供细胞移植的种子细胞。方法征得孕妇及家属同意并书面签署知情同意书后,收集经剖腹产分娩的羊膜组织,采用胰酶消化法获取h AECs;通过观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物的表达,对分离培养的h AECs进行鉴定;通过细胞免疫荧光检测h AECs表达卵泡刺激素受体（Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR）的情况。结果分离纯化的h AECs呈铺路石样,细胞大小及形态均一,呈圆形或多角形,并呈集落样生长;4代后细胞渐呈梭形,细胞增殖减慢;h AECs高表达干细胞标志物（SSEA4,Nanog）、上皮细胞标志物（CD324,CD326）;而低表达间充质细胞标志物（CD105）、造血干细胞标志物（CD34、CD45）和免疫学标志物（HLA-DR）;h AECs可以表达颗粒细胞的标志物FSHR。结论h AECs来源丰富,具有干细胞及上皮细胞特性,低免疫原性,无成瘤性,在干细胞治疗领域中具有广阔的应用前景。第二部分 环磷酰胺诱导大鼠卵巢损伤模型的建立目的建立稳定的环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的动物模型。方法将8-10周龄有规律动情周期的SD大鼠随机分为4组（环磷酰胺注射第1天记为D1）:对照组（D1-D15 0.9%生理盐水）;低剂量环磷酰胺损伤组（D1 50mg/kg,D2-D15 8mg/kg）;中剂量环磷酰胺损伤组（D1 100mg/kg,D2-D15 8mg/kg）;高剂量环磷酰胺损伤组（D1200mg/kg,D2-D15 8mg/kg）。（1）观察大鼠一般状态,称量体重及卵巢重量,绘制大鼠的生存曲线;（2）检测大鼠的动情周期改变,分析环磷酰胺对大鼠卵巢的毒性作用;（3）化学发光法检测化疗结束后3天及2周的血清雌激素E2水平,了解环磷酰胺对大鼠内分泌功能的作用;（4）Elisa检测化疗结束后2周的血清AMH及FSH水平,了解环磷酰胺对大鼠内分泌功能的作用;（5）HE染色观察大鼠卵巢组织学改变及卵泡计数,评估环磷酰胺对卵巢组织学的损伤情况及对卵泡的作用。结果（1）低剂量环磷酰胺组大鼠体重及卵巢重量降低,死亡率低,中、高剂量环磷酰胺组大鼠死亡率高,故选用低剂量环磷酰胺构造卵巢功能不全的模型;（2）模型组大鼠的血清雌激素E2水平较对照组在化疗结束后3天有所下降,在化疗结束后2周明显下降;（3）模型组大鼠的血清AMH较对照组在化疗结束后2周明显下降,而FSH水平较对照组在化疗结束后2周明显上升;（4）模型组及对照组大鼠在化疗开始前均有规律的动情周期,化疗开始后1周,模型组约54%的大鼠出现异常的动情周期,化疗结束后1周模型组仍有46%的大鼠表现为异常的动情周期,而此过程对照组大鼠均有正常的动情周期;（5）环磷酰胺给药后卵巢组织损伤明显,卵巢纤维化明显,模型组较对照组窦前卵泡、窦卵泡明显减少,而闭锁卵泡显着增加。结论低剂量环磷酰胺经腹腔注射（D1 50mg/kg,D2-D15 8mg/kg）,可以建立稳定的环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的模型。第三部分 hAECs修复大鼠卵巢卵巢功能不全的有效性研究目的探究h AECs修复环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的有效性及对生育力的影响,并初步探究h AECs治疗的机制。方法选用PHK26荧光染料成功标记第1代h AECs,用于h AECs移植的体内追踪。将8-10周龄的SD大鼠纳入实验,将大鼠随机分为4组,以第1次腹腔注射环磷酰胺或生理盐水记为第1天（D1）。对照组（D1-15腹腔注射0.9%生理盐水,D16尾静脉注射PBS,双卵巢原位注射PBS）;模型组（D1-15腹腔注射环磷酰胺,D16尾静脉注射PBS,双卵巢原位注射PBS）;h AECs经尾静脉移植组（D1-15腹腔注射环磷酰胺,D16尾静脉注射h AECs,双卵巢原位注射PBS）;h AECs经卵巢原位移植组（D1-15腹腔注射环磷酰胺,D16尾静脉注射PBS,双卵巢原位注射h AECs）。（1）实验中观察大鼠一般状态,称取大鼠体重及卵巢重量;（2）卵巢组织冰冻切片后观察细胞移植后24小时及2周后PKH26标记的h AECs在卵巢中的存活与分布情况;（3）Elisa检测血清中AMH及FSH水平,分析h AECs移植对大鼠内分泌功能的影响;（4）阴道涂片检测大鼠动情周期改变,了解h AECs移植对下丘脑-垂体-性腺轴的完整性的作用;（5）HE染色观察卵巢组织学改变及卵泡计数,评估h AECs修复大鼠卵巢组织结构的效果;（6）免疫组化检测AMH、FSHR及Klotho蛋白在卵巢的分布及表达情况,初步探究h AECs移植修复卵巢损伤可能的机制;（7）大鼠合笼实验探究并记录大鼠胚胎的数量,评估h AECs移植对大鼠生育力的作用。结果（1）PKH26标记的h AECs可以向损伤的卵巢迁移,在细胞移植后24小时、2周均可以观察到红色荧光,移植的h AECs主要分布于卵巢间质区;（2）h AECs移植后可以在一定程度上提高损伤大鼠的体重及卵巢重量;（3）与模型组相比,h AECs移植可以升高损伤大鼠血清AMH水平,并降低血清FSH水平,改善卵巢功能不全大鼠的内分泌功能;（4）h AECs移植可降低损伤大鼠的异常动情周期,降低环磷酰胺所致的卵巢毒性作用;（5）h AECs移植使窦前卵泡、窦卵泡数量增加,闭锁卵泡数量减少,对卵巢组织有修复作用;（6）与模型组相比,h AECs移植可使卵巢组织AMH、FSHR及Klotho蛋白的表达水平上调;（7）h AECs尾静脉移植组、h AECs原位注射组及模型组大鼠的胚胎数量较对照组显着减少,尾静脉移植细胞组大鼠合笼后胚胎数较模型组明显增加,原位注射细胞组大鼠的胚胎数量较模型组略有增加。结论h AECs移植可以修复损伤的卵巢功能和结构,增加窦前及窦卵泡的数量,减少闭锁卵泡的数量;h AECs静脉移植可以显着改善受损大鼠的生育力功能;h AECs移植可以使卵巢组织AMH、FSHR及Klotho蛋白的表达水平上调,可能与抑制原始卵泡过度激活、促进生长卵泡发育、成熟及调节颗粒细胞的功能有关。第四部分 hAECs修复大鼠卵巢功能不全的机制研究目的h AECs修复大鼠卵巢功能不全的可能机制,希望为化疗引起的卵巢损伤的治疗提供相关理论基础,为临床上修复损伤的卵巢功能提供新的思路和策略。方法在已经证实h AECs在修复环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的可行性后,本实验选用RNA SEQ进行三组卵巢组织的测序,每组含3例卵巢组织。三组分别为h AECs尾静脉移植组、h AECs原位注射组及模型组,在h AECs移植后2周取卵巢组织进行测序及进一步验证。（1）卵巢组织的总RNA提取、逆转录、合成双链c DNA、扩增及测序,生物信息学分析h AECs治疗组与模型组的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,对差异表达基因的GO（Gene Ontology）及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析,了解差异基因的功能及可能涉及的通路;（2）RT-q PCR验证部分差异表达基因,进一步明确差异基因的表达水平;（3）免疫组化及Western Blot验证显着富集的类固醇激素合成通路的蛋白表达水平,从基因及蛋白表达水平探究h AECs治疗的潜在机制。结果（1）m RNA测序发现h AECs尾静脉移植组和模型组共有783个表达差异的基因,其中有619个上调的差异基因及164个下调的差异基因。而原位注射h AECs组与模型组之间有168个差异表达基因,其中116个上调的差异基因和52个下调的差异基因;（2）GO分析显示,h AECs尾静脉移植组与模型组的DEGs主要富集于离子通道活性和跨膜转运蛋白活性,而原位注射h AECs组与模型组的DEGs显着富集类固醇激素生物合成过程和类固醇激素代谢过程。KEGG分析显示,h AECs尾静脉移植组与模型组的DEGs在核糖体、蛋白消化和吸收通路、神经活动配体-受体相互作用通路及c AMP信号通路显着富集;而原位注射h AECs组与模型组的DEGs主要参与类固醇激素生物合成通路;（3）绘制维恩图发现尾静脉注射细胞组与原位注射细胞组相对于模型组共同差异表达的基因共有4个,包括2个上调和2个下调的基因。在进一步的q PCR验证中,2个上调差异基因IRF7（regulatory factor 7）与Mx1（Mx dynamin-like GTPase 1）表达与测序结果一致,即IRF7与Mx1在尾静脉注射细胞组与原位注射细胞组的表达均显着增加,相对于模型组卵巢组织的表达。而另两个下调差异基因MFAP31（microfibril-associated glycoprotein 3-like）及CITED2（c AMP-responsive element-binding protein（CREBBP）/p300-interactingtrans-activator 2 with glutamic acid（E）and aspartic acid（D）-rich tai）在q PCR的验证中,三组无显着差异;（4）KEGG分析显示原位注射组与模型组间DEGs主要富集于类固醇激素生物合成通路,进一步q PCR发现,Msmo1、SQLE、NSDH1、FDFT1、TM7SF2在原位注射组显着上调,而其他三个基因DHCR24,CYP51,HSD17B7仍然高于模型组,这与测序结果比较一致;m RNA测序结果显示,与模型组相比,原位注射h AECs组中与合成雌激素和黄体酮的关键酶如Star、Cyp11a1、Cyp19a1和Hsd17b1的表达值（FPKM值）也升高。此外,我们还观察分析了3组中血管内皮生长因子受体1（Vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1）、VEGFR2和VEGFR3的表达。VEGFR1（原位注射h AECs组）和VEGFR2（静脉移植h AECs组）的表达分别较模型组显着升高（P<0.05）,而VEGFR3在3组间无差异;（5）免疫组化和western blotting分析发现,原位注射细胞组与模型组之间DEGs显着富集的类固醇激素生物合成通路的其中2个酶角鲨烯单加氧酶（Squalene monooxygenase,SQLE）和法尼基二磷酸法尼基转移酶1（Farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1,FDFT1）主要在卵巢黄体组织的颗粒细胞中表达,原位注射组的表达较模型组显着升高（P<0.01）。结论h AECs移植可能通过上调AMH表达,减少原始卵泡的过度激活;增加FSHR及KL蛋白表达,维持生长卵泡的发育及促进卵泡成熟;高通量测序结果显示h AECs移植对核糖体、蛋白消化、蛋白吸收、神经活性配体-受体相互作用、c AMP信号通路、甾体生物合成通路等均有影响,促进类固醇激素合成、卵泡发育和排卵;此外,h AECs移植还可通过上调促血管及抗炎因子IRF7、Mx1、VEGFR1及VEGFR2,促进血管生成,减少炎症等发挥修复作用。
韦茏芹[6]（2020）在《鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证》文中研究指明转基因鸡输卵管生物反应器具有高产蛋能力,转基因鸡群快速扩繁能力和与人类相似的蛋白糖基化形式,在药用蛋白生产方面具有不可替代的作用。到目前为止,相继建立了鸡蛋卵白（eggwhite）中表达干扰素、溶菌酶、抗体、促红细胞生成素、表皮生长因子等重组蛋白的转基因鸡。但是对于不同长度卵清蛋白启动子（OVP）活性,以及雌激素应答元件（ERE）和卵清蛋白上游启动子转录因子（COUP-TF）调控作用缺乏系统研究;其次,作为外源基因转移的有效载体,鸡原始生殖细胞（PGCs）分离培养方法也待探讨。本研究的目的是确定鸡OVP核心区域,筛选高转录活性的OVP;探讨ERE和COUP-TF调控作用;摸索鸡PGCs适宜培养方法;通过体外和体内验证试验,确定可望用于制备输卵管生物反应器的OVP。1.CRISPR-d Cas9-VP64介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析。将启动子cERE-cOVP-2785、cOVP-2785分别亚克隆至p GL3-Basic载体,构建了荧光素酶表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785、p GL3-cOVP-2785。利用Lipofectamine?2000将上述2个质粒以及p GL3cOVP-1548分别与p RL-TK质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,评估三个启动子的转录活性。利用在线软件Optimized CRISPR Design,依据鸡卵清蛋白（OVA）基因第一内含子、转录起始位点上游区域DNA序列,共设计11对sg RNA;依据鸡ERE序列设计了2对sg RNA,分别构建了11个p GL3-U6-OVPsg RNA和2个p GL3-U6-EREsg RNA重组质粒;将p GL3-cERE-cOVP-2785、pc DNAd Cas9或pc DNA-d Cas9-VP64质粒分别与单个或多个sg RNA表达质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,评估启动子和ERE对荧光素酶表达的影响。结果表明,（1）cERE-cOVP-2785启动子片段的转录活性最高,cOVP-2785次之;（2）d Cas9-VP64对荧光素酶激活效应强于d Cas9;（3）多个sg RNA引导的d Cas9-VP64转录激活效应优于单个sg RNA;（4）第1内含子和转录起始位点上游以及ERE区域每个sg RNA均能靶向激活荧光素酶表达。（5）培养液中添加雌激素显着提升荧光素酶表达水平。2.鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ（COUP-TFⅠ/Ⅱ）功能分析。构建pcDNA3.1-His C-COUP-TFⅠ及pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅡ重组质粒,利用Lipofectamine?2000分别或共同将pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅠ和pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅡ与p GL3-cERE-cOVP-2785或p GL3-cOVP-2785以及p RL-TK质粒共转染293 T细胞,检测荧光素酶活性,以此评估COUPTFⅠ/Ⅱ对荧光素酶表达调控作用。结果表明,（1）COUP-TFI/II与cEREOVP2785联合作用,上调荧光素酶表达,发挥正调控作用;（2）COUP-TF I/II与OVP2785联合作用,下调荧光素酶表达,呈现负调控作用;（3）COUPTFI和COUP-TFII两个转录因子发挥协同作用,调控荧光素酶表达,且COUP-TFⅡ调控作用大于COUP-TFⅠ。3.鸡原始生殖细胞（PGCs）的分离及培养。分别采用Ficoll密度梯度离心法和酶消化法从HH-14期鸡胚血液和HH-28期鸡胚性腺中分离PGCs,分别接种至BRL、STO和CEF饲养层上,比较PGCs增殖能力,并对其生物学特性加以鉴定;此外,对DMSO和乙二醇的冻存效能进行了对比研究。结果表明,（1）来自性腺的PGCs（g PGCs）增殖能力优于来自血液的PGCs（b PGCs）;（2）以BRL为饲养层,在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/m L）、b FGF（4ng/m L）和LIF（10TU/m L）,可以使PGCs连续培养100天以上,是鸡PGCs培养的优选方法;（3）鸡PGCs对PAS和AKP染色,以及SSEA-1免疫荧光染色均呈现阳性反应,在体外分化培养时能形成类胚体;（4）与10%DMSO相比,用10%乙二醇冻存的鸡PGCs复苏后成活率较高,是鸡PGCs适宜的冻存剂。4.鸡卵清蛋白启动子体内外功能验证。采用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent,将慢病毒载体p Lenti6.4/cERE-cOVP-2785/c SLP-EGFP与包装质粒ps PAX2和p MD2.G以及p RSV-Rev共转染293T细胞,超速离心法浓缩慢病毒,La SRT法测定慢病毒滴度。慢病毒体外感染鸡OECs、鸡性腺PGCs以及293T细胞,以EGFP表达效率体外验证cERE-cOVP-2785功能;慢病毒注射2.5日龄鸡胚背主动脉,换壳培养,直至出壳。荧光蛋白手电筒和配套滤镜观察鸡胚性腺EGFP表达效率,PCR检测EGFP整合效率,体内验证cERE-cOVP-2785功能。结果表明,（1）EGFP在鸡OECs、性腺PGCs均有表达,但在293T细胞中没有表达,说明该启动子具有组织特异性;（2）EGFP在鸡胚性腺中表达,且EGFP可整合宿主性腺基因组,表明cERE-cOVP-2785能有效驱动外源基因在性腺中表达,但转基因表达稳定性尚需进一步验证。结论:卵清蛋白基因转录起始位点上游-54～-807bp区域和第1内含子均为卵清蛋白启动子核心序列;cERE-cOVP-2785是适宜的卵清蛋白启动子,因为其转录活性高,ERE具有增强子作用;COUP-TFⅠ/Ⅱ与cERE-cOVP-2785,对下游基因发挥正调控作用;以BRL为饲养层,在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/m L）、b FGF（4ng/m L）和LIF（10TU/m L）,是鸡g PGCs培养的优选方法;启动子cERE-cOVP-2785可以有效驱动EGFP体外和体内特异性表达,有望用于输卵管特异性表达转基因鸡研究。
李世军[7]（2020）在《牛PLIN1基因转录调控机制及其对前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢的作用研究》文中指出脂滴包被蛋白（perilipin,PLIN1）是一种在真核生物中由PLIN1基因编码的蛋白质。PAT家族是与脂滴表面蛋白相关的蛋白质家族。PLIN1的磷酸化对脂肪组织中脂肪代谢有重要作用,在脂肪细胞中调节脂肪分解和脂肪储存起重要作用。PLIN1包被在脂滴外层,可阻止体内脂肪酶进入脂滴,如激素敏感性脂肪酶（HSL）和脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）。PLIN1基因对脂肪分解具有双向调控作用:基础状态下,PLIN1包被于脂滴表面,阻止脂肪酶接触到脂滴内的甘油三酯,从而抑制脂肪分解;能量需求增加时,c AMP-PKA信号通路被激活,PLIN1磷酸化促进脂解。为了探究牛PLIN1基因对牛脂肪细胞增殖分化和脂类代谢的调控作用,本研究以秦川肉牛初生犊牛前体脂肪细胞为实验材料,通过腺病毒介导过表达和干扰PLIN1基因的方法,来探讨PLIN1基因在调控牛前体脂肪细胞增殖分化过程及脂类代谢中作用,主要研究内容如下:1、PLIN1基因多态位点与秦川肉牛生长性状和肉质性状的关联分析检测PLIN1基因在秦川肉牛12个不同组织部位中的表达量,牛PLIN1基因在皮下脂肪组织中表达量显着高于其它组织（p<0.01）。在510头秦川肉牛样本中,通过直接测序检测到PLIN1基因上存在5个SNP位点,分别是g.3579T>C、g.3897G>A、g.8332G>A、g.10516T>C和g.10537G>T。关联分析显示,这5个SNP位点与秦川肉牛部分生长发育性状和肉质性状紧密关联。单倍型组合型H2H4可作为有效分子标记用于秦川肉牛育种。2、转录因子E2F1、PLAG1、C/EBPβ和SMAD3对PLIN1基因的转录调控作用克隆得到PLIN1基因5’端上游序列1978bp,通过逐段缺失及双荧光素酶活检测确定PLIN1基因核心启动子区位于-209～-17bp之间。在核心启动子区域预测并筛选得到C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等重要转录因子。通过定点突变和干扰试验,C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等转录因子在维持PLIN1基因启动子活性中起到重要作用。进一步通过EMSA实验,在体外验证C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等转录因子是PLIN1基因的关键转录因子,验证了PLIN1基因在牛脂肪细胞中有重要调控作用。3、PLIN1基因对牛前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢作用通过构建牛PLIN1基因腺病毒过表达和干扰载体,并包装获得过表达重组腺病毒Ad-PLIN1和干扰重组腺病毒sh-PLIN1。在牛前体脂肪细胞中,过表达PLIN1基因在m RNA水平上促进PLIN1、FASN、PPARγ、ACC、LPL、FABP4、DGAT2和C/EBPβ等基因的表达,抑制了PLIN2和ATGL等脂肪代谢基因的表达,在蛋白水平上促进PLIN1、FASN、PPARγ、ACC、LPL、FABP4和DGAT2等基因的表达,抑制了ATGL基因的表达;类似地在牛前体脂肪细胞中干扰PLIN1基因则会有相反的结果。在过表达PLIN1基因后,油红O染色结果显示脂肪细胞中脂滴数目增加且体积增大,甘油三酯检测含量也增加;干扰PLIN1基因后,脂肪细胞中脂滴的数目减少且体积变小,甘油三酯含量减少,说明PLIN1基因能够促进牛前体脂肪细胞甘油三酯积累,在脂肪代谢中有重要调节作用。4、基于转录组测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘通过转录组测序（RNA-seq）对过表达腺病毒Ad-PLIN1和Ad-NC（空载病毒）处理后的牛前体脂肪细胞差异表达基因进行分析。通过转录组测序分析,共检测到1923个差异表达基因,对差异基因GO分析和KEGG信号通路分析,部分差异基因富集在与脂肪增殖分化相关的AMPK信号通路、Wnt信号通路和PPAR信号通路上,在转录水平说明PLIN1基因对脂肪增殖和代谢有重要调节作用。测序结果也筛选了新的与脂肪代谢相关通路的差异基因,为秦川肉牛的分子育种提供理论支持。5、基于小RNA测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘进一步研究PLIN1基因对脂类代谢的影响,对转录组测序个体进行small RNA测序。对测序结果分析,共鉴定到719个已知mi RNAs和112个新的mi RNAs,发现34个差异表达mi RNA,其中18个mi RNA上调,16个mi RNA下调,对差异表达mi RNA靶基因进行预测共得到6000个靶基因。对差异表达mi RNA靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析,其中部分富集在MAPK信号通路、c GMP-PKG信号通路和m TOR信号通路等脂肪代谢、蛋白质代谢和细胞免疫信号通路。通过m RNA-seq与small RNA-seq整合分析,依据mi RNA与其靶基因间的对应关系对差异表达mi RNA的靶基因进行GO富集和KEGG通路分析,主要富集在Wnt信号通路、氨基酸的生物合成、p53信号通路和MAPK信号通路。综上所述,本研究通过构建逐段缺失载体和EMSA实验对牛PLIN1基因的转录调控机制初步研究,运用高通量测序RNA-seq和small RNA-seq运用多组学分析从m RNA-mi RNA水平研究PLIN1基因在脂类代谢中的作用。
李涛[8]（2020）在《间质干细胞亚群及其胞外囊泡对卵巢癌和乳腺癌影响的研究》文中研究指明目的:本研究尝试将我们新发现的抗肿瘤间质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）亚群及其来源的胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）应用于女性恶性肿瘤（卵巢癌和乳腺癌）的治疗。深入探讨CD90low MSCs亚群在肿瘤治疗中的作用,并为肿瘤的治疗提供理论依据和治疗靶点。为EVs作为一种新型有效的治疗或药物传递媒介提供依据,同时也为治疗其它类型肿瘤提供新的思路和见解。方法:（1）对不同组织进行酶消化法分离培养获得骨髓来源间质干细胞（Bone marrow-derived MSCs,BM-MSCs）、骨密质来源间质干细胞（Compact bone-derived MSCs,CB-MSCs）和脂肪来源间质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）。（2）利用细胞的形态特征、流式细胞术分析细胞表面标志和多向分化能力的检测对MSCs进行鉴定。（3）利用卵巢癌小鼠肿瘤模型评价CB-MSCs、BM-MSCs和CB-MSCs与VIC-008联合的抗肿瘤效果。（4）利用qRT-PCR评价CB-MSCs在3D培养中细胞因子的变化。（5）使用LPS将CD90high ADSCs诱导成CD90low ADSCs,利用小鼠肿瘤模型评价CD90high ADSCs和CD90lowow ADSCs亚群抗肿瘤效果。（6）采用超速离心法分离CD90high ADSCs和CD90low ADSCs来源的EVs(CD90high ADSC-EVs和CD90low ADSC-EVs)。（7）通过TEM和SEM检测EVs的形态特征;Western-blot检测EVs的蛋白标志物;纳米粒子跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）EVs的浓度和大小分布。（8）平板克隆实验评价CD90high ADSC-EVs和CD90low ADSC-EVs对乳腺癌细胞增殖能力的影响。（9）Transwell和划痕实验评价CD90high ADSC-EVs和CD90low ADSC-EVs对乳腺癌细胞迁移能力的影响。（10）利用乳腺癌小鼠肿瘤模型评价CD90high ADSC-EVs和CD90low ADSC-EVs的抗肿瘤效果。（11）利用脂质体融合法将CD90low ADSC-EVs装载miR-16-5p mimics（EVs-miR-16-5p mimic）。（12）利用流式细胞术检测凋亡和小鼠肿瘤模型评价CD90low ADSC-EV-miR-16-5p在体内外对乳腺癌细胞的影响。结果:（1）培养分离的细胞形态呈现成纤维样;细胞表面标记均符合MSCs的一般特征;且该类细胞能够向成脂、成骨和成软骨分化。我们发现CB-MSCs的CD90表达要低于BM-MSCs且CB-MSCs具有抗卵巢癌的作用。3D培养中CB-MSCs的免疫激活细胞因子IL-12、IL-21、IFN-γ和促炎细胞因子CXCL10基因表达增强,而抗炎细胞因子IL-10和CCL5基因表达下调。联合CB-MSCs和VIC-008治疗可显着降低卵巢癌的生长和延长荷瘤小鼠生存期,且能够使肿瘤微环境中活化的抗肿瘤CD4+、CD8+T细胞增多,而使Treg细胞减少,这提示联合治疗具有协同抗肿瘤作用。（2）我们鉴定了CD90high和CD90low ADSCs亚群,并证明了用LPS刺激CD90high ADSCs可以转化为CD90low ADSCs。CD90low ADSC-EVs对乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用。抗肿瘤效果的控制与ADSC-EVs介导乳腺癌细胞增殖和迁移减少、凋亡增强有关。CD90low ADSC-EVs装载抑癌miR-16-5p进一步显着增强了抗肿瘤活性。结论:本研究通过分析CD90在CB-MSCs和BM-MSCs中的表达差异,评价MSCs对卵巢癌小鼠模型的抗肿瘤作用。我们的数据显示CB-MSCs与融合蛋白VIC-008联合应用具有协同抗肿瘤作用,并揭示了CB-MSCs单独或联合VIC-008调节免疫功能的机制。另外,我们还评估了一类新ADSCs亚群在乳腺癌模型中的抗肿瘤活性,并证明ADSC-EVs在装载了抗肿瘤miR-16-5p后,可进一步提高抗肿瘤效果。综上所述,本研究首次将我们新筛选的抗肿瘤MSCs及其EVs应用于卵巢癌和乳腺癌的临床前治疗。此外,也为EVs作为一种新型、有效的治疗药物或药物载体提供了证据。
李梓菲[9]（2020）在《人脂肪间充质干细胞深低温保存的研究》文中研究说明研究背景人脂肪间充质干细胞（hADSCs）的深低温保存对于开展hADSCs细胞库的建立及临床应用至关重要。然而目前仍缺乏针对hADSCs深低温保存的研究。研究目的明确深低温保存前hADSCs分离纯化方法对其生物学特性的影响;明确hADSCs的低温生物学参数;明确hADSCs冷冻流程主要环节对其生物学特性的影响:探索纳米氧化石墨烯对hADSCs深低温保存效果的影响。研究方法第一部分:深低温保存前hADSCs分离纯化方法的研究（一）消化液体积与容器容积之比对酶学法获取基质血管成分（SVF）/hADSCs产量及生物学特性的影响人皮下脂肪抽吸物与酶消化液按0.2、0.4、0.6及0.8消化液体积与容器容积之比进行SVF提取并分析细胞产量及活细胞率、免疫表型、增殖能力及成脂、成骨及成软骨分化能力。（二）氯化铵（NH4C1）裂解法分离纯化hADSCs对其生物学特性的影响人皮下脂肪组织抽吸物提取的SVF,应用NH4C1红细胞裂解液进行处理,非裂解法作为对照。分析SVF细胞产量及活细胞率;分析hADSCs活细胞率、细胞凋亡水平、免疫表型、增殖能力、成脂及成骨分化能力。（三）深低温保存NH4C1裂解法分离纯化hADSCs的生物学特性用如上所述裂解法处理SVF并培养hADSCs,液氮深低温保存2周后复苏,非裂解法为对照。比较深低温保存前后的hADSCs的活细胞率、细胞凋亡水平、免疫表型、细胞增殖能力。第二部分:hADSCs低温生物学参数探索:跨膜水传输与胞内冰形成的研究利用低温显微镜平台采集hADSCs不同降温速率下的细胞图像。通过数学模型拟合水传输参数:细胞膜对水的渗透系数（Lpg）和水传输的活化能（ELp）;以及胞内冰形成参数:动力学参数（ΩOSCN）和热力学参数（kOSCN）,并推算无低温保护剂条件下最佳降温速率。第三部分:hADSCs冷冻流程的研究（一）降温速率对hADSCs生物学特性的影响hADSCs 按 0.5℃/min、1℃/min、1C℃/min、25℃/min、50℃/min、80℃/min和100℃/min的降温速率冷冻并液氮深低温保存3个月,细胞复苏后分析其活细胞率、细胞凋亡水平、免疫表型、细胞增殖能力、成脂、成骨及成软骨分化能力及活性氧（ROS）水平。（二）细胞浓度对深低温保存hADSCs的生物学特性的影响hADSCs 按 0.5 × 106/mL、1×106/mL>2×106/mL、5×106/mL 和 10×106/mL细胞浓度于液氮深低温保存2周。复苏后分析其活细胞率、免疫表型、细胞增殖能力、成脂、成骨及成软骨分化能力。第四部分:纳米氧化石墨烯（GO）在hADSCs深低温保存中的保护作用的研究体外实验部分:对照组（CPA-C）使用常规90%胎牛血清（FBS）+10%DMSO作为低温保护剂,GO组（CPA-GO）在常规低温保护剂基础上增加5 μg/mL GO。hADSCs加入以上两组低温保护剂后深低温保存2周。分析深低温保存前后hADSCs的活细胞率、免疫表型、细胞增殖能力、成脂、成骨及成软骨分化能力、细胞凋亡水平,评估GO对hADSCs的毒性及GO残留情况。体内实验部分:深低温保存后hADSCs行活细胞率、免疫表型、细胞增殖能力、成脂、成骨及成软骨分化能力等生物学特性检测。采用GO组（CPA-GO）、常规低温保护剂对照组（CPA-C）及单纯PBS空白对照组进行hADSCs辅助脂肪移植;各组hADSCs与脂肪组织混合物移植于裸鼠颈部,3个月后取材。评估移植物重量,脂肪细胞成活情况及来源,移植物内血管数量及来源;组织内成脂及凋亡相关基因的表达水平;评估移植物内巨噬细胞浸润情况及炎症因子表达水平。研究结果第一部分:深低温保存前hADSCs分离纯化方法的研究（一）消化液体积与容器容积之比对酶学法获取SVF/hADSCs产量及生物学特性的影响0.4组细胞产量最高,为2.65±0.98X 105个细胞;0.2组活细胞率最高,为76.20±4.91%,0.4组活细胞率次之,为72.96±4.64%。各消化液体积与容器容积之比组hADSCs其余生物学特性无显着差异。（二）氯化铵（NH4Cl）裂解法分离纯化hADSCs对其生物学特性的影响裂解组SVF活细胞数、活细胞率显着低于非裂解组;NH4Cl裂解诱导hADSCs凋亡并降低hADSCs增殖能力;余生物学特性组间无统计学差异。（三）深低温保存NH4Cl裂解法分离纯化hADSCs的生物学特性深低温保存与裂解具有协同促hASCs凋亡的作用;深低温保存前后裂解组细胞增殖能力较非裂解组差。第二部分:hADSCs低温生物学参数探索:跨膜水传输与胞内冰形成的研究联合拟合得到相应的水传输参数为:Lpg=3.79 X 10-14 m/s/Pa（0.23 μm/min/atm）,ELp=154.94 kJ/mol（37.01 kcal/mol）。根据 Generic Optimal Cooling Rate Equation（GOCRE）最佳降温速度推测公式推测的最佳降温速度为4.30℃/min。平均动力学参数ΩOSCN为7.79 X 108 m-2 s-1平均热力学参数kOSCN 为 2.93×109K5。第三部分:hADSCs冷冻流程的研究（一）降温速率对hADSCs生物学特性的影响随着降温速率从50℃/min降低到0.5℃/min,深低温保存后活细胞率有逐渐增高的趋势,0.5℃/min组活细胞率为93.17±2.29%;细胞ROS水平随降温速率的变化趋势近似倒U型,峰值对应的降温速率为25℃/min;80℃/min组保持较强的成软骨能力。（二）细胞浓度对深低温保存hADSCs的生物学特性的影响活细胞率随细胞浓度的增加而增加,至5×106/mL组活细胞率为91.28±2.57%,10×106/mL组活细胞率为93.87±1.80%。各细胞浓度组间生物学特性无显着差异。第四部分:纳米GO在hADSCs深低温保存中的保护作用的研究体外实验部分:0.01-100 μ g/mL GO与hADSCs共培养未见细胞毒性,透射电镜未见明显胞内GO残留。低温保护剂内添加5 μg/mL GO有助于提高活细胞率及复苏率,减少细胞凋亡水平。体内实验部分:与对照组相比,CPA-GO组脂肪移植物内成活脂肪细胞数及血管数更多;CPA-GO组移植物内鼠源VEGF水平有增高的趋势,炎症因子MCP-1有降低的趋势。研究结论第一部分:深低温保存前hADSCs分离纯化方法的研究0.4可能是酶学消化法分离hADSCs的最佳消化液体积与容器容积之比;hADSCs提取过程中应避免NH4Cl红细胞裂解处理。第二部分:hADSCs低温生物学参数探索:跨膜水传输与胞内冰形成的研究hADSCs细胞膜对水的通透性较低,且在相对较高的温度范围内易出现胞内冰,降温速率应足够慢以减少胞内冰的形成。第三部分:hADSCs冷冻流程的研究以0.5℃/min降温速率冷冻hADSCs可以保持较高的活细胞率及较佳的生物学特性;5×106/mL至10×106/mL可作为大批量深低温保存hADSCs的适宜细胞浓度。第四部分:纳米GO在hADSCs深低温保存中的保护作用的研究纳米GO在hADSCs的深低温保存中发挥保护作用。
李文秀[10]（2019）在《RNA干扰介导的NUF-2基因表达下调对肝细胞癌增殖及细胞周期的影响》文中研究说明目的:研究NUF-2基因表达下调对肝细胞癌的增殖及细胞周期的影响。材料与方法:1.选定HepG2、BEL-7404、SMMC-7721、BEL-7402四种肝癌细胞株与正常肝细胞株HL-7702为研究目标,利用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检验NUF-2在上述细胞中的表达情况;2.挑选NUF-2高表达的肝癌细胞株,通过RNA干扰技术构建抑制NUF-2基因表达的慢病毒载体;3.用慢病毒感染选定的肝癌细胞株,获取NUF-2被稳定抑制表达的肝癌细胞株;4.通过qRT-PCR检测肝癌细胞中NUF-2 mRNA表达情况;5.通过Western blotting检验肝癌细胞抑制NUF-2表达后蛋白表达效果;6.通过Celigo细胞荧光计数法及MTT实验检测抑制NUF-2表达后肝癌细胞增殖能力的影响;7.通过流式细胞仪检测抑制NUF-2表达后肝癌细胞细胞周期的改变情况。结果:1.在4种人肝癌细胞系（SMMC-7721、HepG2、BEL-7404、BEL-7402）中NUF-2基因的表达:荧光实时定量PCR（qRT-PCR）实验结果显示,4种肝癌细胞系（HepG2、BEL-7404、SMMC-7721、BEL-740）的NUF-2的mRNA水平较正常肝癌细胞系HL-7702显着增高,其中以肝癌细胞SMMC-7721的mRNA表达量最高;2.通过慢病毒介导抑制SMMC-7721人肝癌细胞中的NUF-2,实验结果显示,体外NUF-2的缺失明显抑制了肝细胞癌蛋白形成能力,此外,抑制NUF-2表达,可显着下降肝癌细胞增殖能力,可诱导细胞周期阻滞,处于G1期的肝癌细胞增多。结论:NUF-2基因在人肝细胞癌中表达明显增高,抑制NUF-2表达,可显着下降肝癌细胞增殖能力,使细胞周期阻滞。
二、一种肝细胞联合冷冻保存的新方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种肝细胞联合冷冻保存的新方法（论文提纲范文）
（1）白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 精原干细胞概述 |
| 1.1.1 精原干细胞与精子发生 |
| 1.1.2 精原干细胞的分离与纯化 |
| 1.1.3 精原干细胞的标记物 |
| 1.1.4 精原干细胞微环境 |
| 1.1.5 精原干细胞的体外培养 |
| 1.2 精原干细胞的冷冻保存 |
| 1.2.1 冷冻保存原理 |
| 1.2.2 冷冻及解冻方法 |
| 1.2.3 冷冻保护剂 |
| 1.2.4 冷冻保存与氧化应激 |
| 1.2.5 冷冻保存与细胞凋亡 |
| 1.2.6 冷冻保存与细胞自噬 |
| 1.3 白藜芦醇的研究进展 |
| 1.3.1 白藜芦醇的主要信号通路 |
| 1.3.2 白藜芦醇的抗氧化作用 |
| 1.3.3 白藜芦醇的抗凋亡作用 |
| 1.3.4 白藜芦醇与细胞自噬 |
| 1.3.5 白藜芦醇与AMPK |
| 1.3.6 白藜芦醇对细胞冷冻保存的研究 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 奶山羊精原干细胞的分离与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 奶山羊睾丸的HE染色 |
| 2.3.2 奶山羊睾丸的PGP9.5 免疫组织化学染色 |
| 2.3.3 不同日龄奶山羊睾丸中PGP9.5和THY1 蛋白的表达 |
| 2.3.4 奶山羊SSCs的分离与纯化 |
| 2.3.5 SSCs的免疫荧光染色鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 白藜芦醇对冷冻保存奶山羊精原干细胞活力及抗氧化能力的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.3 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 白藜芦醇对冷冻保存SSCs活性的影响 |
| 3.3.2 白藜芦醇对冷冻保存SSCs活率的影响 |
| 3.3.3 白藜芦醇对冷冻保存SSCs T-AOC的影响 |
| 3.3.4 白藜芦醇对冷冻保存SSCs内 ROS水平的影响 |
| 3.3.5 白藜芦醇对冷冻保存SSCs MDA含量的影响 |
| 3.3.6 白藜芦醇对冷冻保存SSCs线粒体膜电位的影响 |
| 3.3.7 白藜芦醇对冷冻保存SSCs抗氧化酶活性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 白藜芦醇保护冷冻保存奶山羊精原干细胞机制的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.2.3 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 流式细胞术检测SSCs凋亡 |
| 4.3.2 SSCs凋亡相关蛋白的表达 |
| 4.3.3 SSCs自噬相关蛋白的表达 |
| 4.3.4 SSCs的 AMPK磷酸化水平 |
| 4.3.5 SSCs的超微结构观察 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）LR12在TAA诱导的急性肝衰竭中的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LR12 减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LR12 通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LR12 通过促进巨噬细胞分泌CCL20 促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 LR12 通过促进巨噬细胞分泌CCL20 激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 急性肝衰竭的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）二肽基肽酶-Ⅳ检测新方法的建立及其在大鼠脏器损伤评价中的比较性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、二肽基肽酶-Ⅳ |
| 二、药物性脏器损伤 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DPP-Ⅳ液相色谱-荧光检测法及组织残余活性法的建立 |
| 一、材料与方法 |
| (一)材料 |
| 1.试剂 |
| 2.样本 |
| 3.仪器设备 |
| 3.1 液相色谱 |
| 3.2 其它 |
| (二)方法 |
| 1.液相色谱条件 |
| 2.色谱条件的方法验证 |
| 3.细胞匀浆S9的制备 |
| 4.无细胞上清液的制备 |
| 5.DPP-Ⅳ活性检测 |
| 6.ELISA检测 |
| 7.酶动力学分析 |
| 8.化学抑制试验 |
| 二、结果与讨论 |
| (一)结果 |
| 1.分析方法优化 |
| 2.方法学验证 |
| 3.人组织微粒体中DPP-Ⅳ活性的测定 |
| 4.细胞DPP-Ⅳ活性测定 |
| 5.细胞上清DPP-Ⅳ活性测定 |
| 6.DPP-Ⅳ抑制剂的筛选和表征 |
| (二)结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 正常大鼠体内主要脏器DPP-Ⅳ及其它标志物的活性差异 |
| 一、材料与方法 |
| (一)材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.试剂 |
| 3.仪器 |
| (二)方法 |
| 1.大鼠灌胃取材 |
| 2.肝脏组织分叶及样本采集 |
| 2.1 非PBS全身灌流大鼠样本采集 |
| 2.2 PBS全身灌注组织大鼠样本取材 |
| 3.肝脏S9匀浆制备 |
| 4.传统脏器损伤标志物检测 |
| 5.DPP-Ⅳ酶活性检测 |
| 6.变异度分析方法 |
| 二、结果与讨论 |
| (一)结果 |
| 1.各正常大鼠体重、总肝重差异 |
| 2.正常大鼠传统血清学指标差异 |
| 3.大鼠各脏器DPP-Ⅳ酶比活性差异 |
| 4.大鼠肝脏各分叶DPP-Ⅳ酶比活性差异 |
| 5.大鼠各脏器DPP-Ⅳ总活性差异 |
| 6.由正常大鼠肝脏各分叶DPP-Ⅳ酶活推算肝脏总活性的差异 |
| (二)结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ANIT诱导大鼠肝损伤中评价方法的比较性研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一)材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.试剂 |
| 3.仪器 |
| (二)方法 |
| 1.ANIT诱导大鼠肝损伤造模 |
| 2.肝脏组织分叶及样本采集 |
| 2.1 非PBS全身灌流大鼠样本采集 |
| 2.2 PBS全身灌注组织大鼠样本取材 |
| 3.组织病理切片制备与组织学分析评分 |
| 4.肝脏S9匀浆制备 |
| 5.传统脏器损伤标志物检测 |
| 6.胆汁收集 |
| 7.DPP-Ⅳ酶活性检测 |
| 8.变异度与统计学分析方法 |
| 8.1 均值与相对标准差计算 |
| 8.2 正态分布 |
| 8.3 ROC及AUC计算 |
| 8.4 t检验 |
| 8.5 样本量的计算 |
| 二、结果与讨论 |
| (一)结果 |
| 1.非灌流清洗的ANIT诱导肝损伤大鼠指标变化 |
| 1.1 ANIT诱导损伤后大鼠总体重及其各脏器重量的变化 |
| 1.2 ANIT诱导肝损伤大鼠组织病理学变化 |
| 1.3 ANIT诱导大鼠传统肝损伤指标在血清与组织中的变化 |
| 1.4 ANIT诱导大鼠肝损伤后各主要脏器DPP-Ⅳ活性变化 |
| 1.5 ANIT损伤前后大鼠肝脏各分叶DPP-Ⅳ酶比活性变化 |
| 1.6 ANIT损伤前后由大鼠肝脏各分叶DPP-Ⅳ活性推算的总肝活性的变化 |
| 2.灌流清洗后ANIT诱导肝损伤大鼠指标变化 |
| 2.1 灌流后ANIT诱导肝损伤大鼠胆汁流量变化 |
| 2.2 灌流后ANIT诱导肝损伤大鼠传统血清学指标变化 |
| 2.3 灌流后ANIT诱导肝损伤大鼠血清中DPP-Ⅳ的活性变化 |
| 2.4 灌流后ANIT诱导肝损伤大鼠肝脏DPP-Ⅳ酶比活性变化 |
| 2.5 灌流后ANIT诱导肝损伤大鼠DPP-Ⅳ组织残余总活性变化 |
| (二)讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 CCL_4诱导大鼠肝损伤中评价方法的比较性研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一)材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.试剂 |
| 3.仪器 |
| (二)方法 |
| 1.CCl_4诱导大鼠肝损伤造模方法 |
| 2.肝脏分叶标准、组织样本采集与肝重系数计算 |
| 3.肝脏S9匀浆液制备 |
| 4.传统肝损伤血清学标志物检测 |
| 5.DPP-Ⅳ酶活性检测 |
| 6.变异度与统计学分析方法 |
| 二、结果与讨论 |
| (一)结果 |
| 1.CCl_4诱导损伤后大鼠体重及其各脏器重量的变化 |
| 2.CCl_4诱导肝损伤大鼠组织病理学变化 |
| 3.CCl_4诱导大鼠传统肝损伤指标在血清与组织中的变化 |
| 4.CCl_4诱导大鼠损伤后血清DPP-Ⅳ活性变化 |
| 5.CCl_4诱导大鼠损伤后各脏器DPP-Ⅳ活性变化 |
| 6.CCl_4诱导肝损伤大鼠各肝叶DPP-Ⅳ比活性变化 |
| 7.CCl_4诱导肝损伤前后由各取材点推算的肝脏DPP-Ⅳ总组织残余活性变化 |
| (二)讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望 |
| 第六部分 文献综述 药物性消化道系统损伤标志物及其评价 |
| 一、消化道组成及功能 |
| 二、消化道损伤评估 |
| 三、消化道损伤药物 |
| 四、消化道损伤标志物 |
| 结束语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（4）两性离子分子甜菜碱在间充质干细胞冷冻保存中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 干细胞治疗 |
| 1.2 细胞冻存 |
| 1.2.1 细胞冻存概述 |
| 1.2.2 细胞冻存的发展 |
| 1.2.3 MSCs冻存 |
| 1.3 两性离子分子 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 两性离子分子用于细胞冻存 |
| 1.4 分子递送方法 |
| 1.4.1 载体介导的外源性分子递送方法 |
| 1.4.2 破坏细胞膜的递送外源性分子方法 |
| 1.5 干细胞示踪技术 |
| 1.6 本研究的意义和研究内容 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第2章 天然两性离子分子甜菜碱结合可逆电穿孔技术冻存间充质干细胞 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验耗材与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 甜菜碱的冻存保护特性 |
| 2.3.3 细胞毒性测试 |
| 2.3.4 UCMSCs对脉冲强度的耐受性测试 |
| 2.3.5 细胞冻存实验 |
| 2.3.6 细胞存活率测试 |
| 2.3.7 复苏后MSCs的功能测试 |
| 2.3.8 细胞凋亡水平测试 |
| 2.3.9 细胞内活性氧水平测试 |
| 2.3.10 UCMSCs表面蛋白标志物的表达水平测试 |
| 2.3.11 UCMSCs的诱导分化潜能测试 |
| 2.3.12 BMMSCs冻存实验 |
| 2.3.13 统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 甜菜碱的冻存保护特性 |
| 2.4.2 甜菜碱的生物相容性 |
| 2.4.3 甜菜碱冻存UCMSCs |
| 2.4.4 UCMSCs对脉冲强度的耐受性 |
| 2.4.5 甜菜碱结合可逆电穿孔技术冻存UCMSCs |
| 2.4.6 UCMSCs的形态、贴壁能力和增殖能力 |
| 2.4.7 UCMSCs的凋亡水平 |
| 2.4.8 UCMSCs的活性氧水平 |
| 2.4.9 UCMSCs表面蛋白标志物的表达和诱导分化潜能 |
| 2.4.10 甜菜碱结合可逆电穿孔技术冻存BMMSCs |
| 2.4.11 甜菜碱结合可逆电穿孔技术对MSCs的冻存保护机理 |
| 2.5 本章小节 |
| 第3章 细胞冻存对UCMSCs体内归巢分布的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验耗材与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 GFP-Fluc-UCMSCs的构建 |
| 3.3.3 流式细胞仪分选 |
| 3.3.4 生物发光成像仪检验GFP-Fluc-UCMSCs的纯度 |
| 3.3.5 GFP-Fluc-UCMSCs表面蛋白标志物以及诱导分化潜能测试 |
| 3.3.6 GFP-FLUC-UCMSCs的细胞冻存实验 |
| 3.3.7 细胞存活率测试 |
| 3.3.8 细胞复苏后的形态以及报告基因的表达水平测试 |
| 3.3.9 UCMSCs的细胞骨架染色 |
| 3.3.10 UCMSCs的趋化因子表达水平测试 |
| 3.3.11 监测GFP-Fluc-UCMSCs在小鼠体内的归巢分布情况 |
| 3.3.12 统计分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 GFP-Fluc-UCMSCs的构建 |
| 3.4.2 高纯度GFP-Fluc-UCMSCs细胞株的获得 |
| 3.4.3 GFP-Fluc-UCMSCs表面蛋白标志物的表达以及诱导分化潜能 |
| 3.4.4 甜菜碱结合可逆电穿孔技术冻存GFP-Fluc-UCMSCs |
| 3.4.5 GFP-Fluc-UCMSCs在小鼠体内的归巢分布情况 |
| 3.4.6 细胞骨架的完整性 |
| 3.4.7 趋化因子的表达水平 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 总结与展望 |
| 4.1 研究结论 |
| 4.2 主要创新点 |
| 4.3 工作展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况 |
| 致谢 |
（5）人羊膜上皮细胞修复大鼠卵巢功能不全的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第1章 hAECs的分离、培养、鉴定与生物学特性分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第2章 环磷酰胺诱导大鼠卵巢损伤模型的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第3章 hAECs修复大鼠卵巢功能不全的体内实验 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 hAECs修复大鼠卵巢功能不全的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 综述 |
| 1 综述一化学治疗引起卵巢功能损伤的机制与治疗措施 |
| 2 综述二羊膜上皮细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 启动子的概念 |
| 1.1.1 核心启动子元件(CPE) |
| 1.1.2 上游启动子元件(UPE) |
| 1.2 鸡卵清蛋白 |
| 1.2.1 卵清蛋白简介 |
| 1.2.2 鸡卵清蛋白的组织特异性与诱导表达 |
| 1.2.3 卵清蛋白增强子序列 |
| 1.3 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子 |
| 1.3.1 COUP-TFs作用的分子机制 |
| 1.3.2 COUP-TFs的生理功能 |
| 1.4 启动子研究分析方法 |
| 1.4.1 启动子预测工具 |
| 1.4.2 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.5 CRISPR-d Cas9 与基因转录后调控 |
| 1.5.1 dCas9简介 |
| 1.5.2 CRISPR-d Cas9 转录激活或转录抑制效应元件 |
| 1.6 鸡原始生殖细胞 |
| 1.6.1 鸡胚原始生殖细胞的起源 |
| 1.6.2 鸡胚原始生殖细胞超微结构 |
| 1.6.3 PGCs的分离 |
| 1.6.4 鸡PGCs分离培养相关影响因素 |
| 1.6.5 PGCs的生物学特性 |
| 1.6.6 PGCs在转基因家禽研究中的应用 |
| 1.7 输卵管特异性表达转基因鸡研究 |
| 1.7.1 转基因鸡研究方法 |
| 1.7.2 输卵管特异性表达转基因鸡研究简史 |
| 1.7.3 输卵管特异基因的高通量筛选及其启动子的应用 |
| 1.7.4 CRISPR/Cas9介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 CRISPR-d Cas9-VP64 介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和试剂 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 含雌激素应答元件的启动子片段(cERE-cOVP-2785)的克隆 |
| 2.3.2 重组表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785 的构建 |
| 2.3.3 重组表达载体p GL3-cOVP-2785 的构建 |
| 2.3.4 sgRNA的设计 |
| 2.3.5 sgRNA表达载体构建 |
| 2.3.6 重组质粒中量抽提 |
| 2.3.7 转染 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 启动子载体构建结果 |
| 2.4.2 质粒与转染试剂转染最优比例筛选 |
| 2.4.3 不同长度启动子活性的比较 |
| 2.4.4 卵清蛋白启动子(cERE-cOVP-2785)不同区域转录活性分析 |
| 2.4.5 雌激素对启动子的影响 |
| 2.4.6 激活雌激素应答元件不同区域作用结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 转录因子重组表达载体构建 |
| 3.3.2 去内毒素重组质粒提取 |
| 3.3.3 COUP-TFⅠ/Ⅱ调控作用 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 含转录因子载体构建结果 |
| 3.4.2 COUP-TFⅠ与COUP-TFⅡ的调控作用 |
| 3.4.3 两个转录因子协同作用分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 鸡原始生殖细胞的分离及培养 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 有关溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 饲养层的准备 |
| 4.3.2 从5.5日龄的鸡胚(28期)性腺中分离PGCs |
| 4.3.3 从2.5日龄的鸡胚(14期)血液中分离PGCs |
| 4.3.4 鸡PGCs的体外培养体系 |
| 4.3.5 PGCs的传代 |
| 4.3.6 PGCs的冷冻保存 |
| 4.3.7 PGCs的复苏 |
| 4.3.8 PGCs的鉴定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 两种不同来源PGCs的分离培养 |
| 4.4.2 两种不同来源PGCs的克隆形成能力 |
| 4.4.3 不同培养体系对鸡PGCs增殖能力的影响 |
| 4.4.4 PGCs的冷冻保存 |
| 4.4.5 PGCs生物学特性鉴定 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 鸡PGCs的分离培养 |
| 4.5.2 鸡PGCs体外长期培养的难点 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 鸡卵清蛋白启动子的功能验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 有关溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 慢病毒的包装 |
| 5.3.2 鸡输卵管上皮细胞(OECs)的分离 |
| 5.3.3 慢病毒体外感染鸡OECs及 PGCs |
| 5.3.4 体外感染后外源基因表达情况检测 |
| 5.3.5 慢病毒体内注射 |
| 5.3.6 外源基因表达检测 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 LaSRT法测定病毒滴度 |
| 5.4.2 OECs细胞分离培养 |
| 5.4.3 cERE-cOVP-2785 体外功能验证 |
| 5.4.4 cERE-cOVP-2785 体内功能验证 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）牛PLIN1基因转录调控机制及其对前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 脂肪细胞分化研究进展 |
| 1.1.1 脂肪组织和脂肪细胞概述 |
| 1.1.2 脂肪代谢研究进展 |
| 1.1.3 研究脂肪细胞增殖分化的模型 |
| 1.2 PAT家族研究进展 |
| 1.2.1 PLIN1基因研究进展 |
| 1.2.2 PLIN2基因研究进展 |
| 1.2.3 TIP47基因研究进展 |
| 1.2.4 S3-12基因研究进展 |
| 1.2.5 非哺乳动物PAT家族蛋白研究进展 |
| 1.3 分子标记辅助育种 |
| 1.4 真核生物转录调控及重要转录因子研究进展 |
| 1.4.1 C/EBPs家族C/EBPβ |
| 1.4.2 E2F家族E2F1 |
| 1.4.3 PLAG基因家族PLAG1 |
| 1.4.4 Smads家族Smad3 |
| 1.5 多组学高通量测序研究进展 |
| 1.5.1 转录组测序研究进展 |
| 1.5.2 small RNA测序研究进展 |
| 1.5.3 miRNA-mRNA联合分析研究进展 |
| 1.6 脂质代谢的重要通路研究进展 |
| 1.6.1 AMPK信号通路的组成及调控机制 |
| 1.6.2 Wnt信号通路的组成及调控机制 |
| 1.6.3 PPAR信号通路的组成及调控机制 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 PLIN1基因表达模式及其多态位点与秦川肉牛生长性状和肉质性状的关联分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器与试剂耗材 |
| 2.2.2 组织样品及血液采集与冷冻保存 |
| 2.2.3 血样DNA的提取、组织样品总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 2.2.4 实时荧光定量qRT-PCR检测 |
| 2.2.5 数据采集 |
| 2.2.6 多态位点检测 |
| 2.2.7 多态位点分型 |
| 2.2.8 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 组织总RNA电泳检测 |
| 2.3.2 PLIN1 基因mRNA表达谱分析 |
| 2.3.3 牛PLIN1基因序列分析 |
| 2.3.4 PLIN1基因序列同源性分析 |
| 2.3.5 PLIN1基因系统进化树 |
| 2.3.6 PLIN1基因多态性位点遗传分析 |
| 2.3.7 PLIN1 基因SNP位点对秦川肉牛肉质和生长性状的影响 |
| 2.3.8 PLIN1基因的连锁不平衡和单倍型关联分析 |
| 2.3.9 PLIN1 基因SNP单倍型组合对秦川肉牛肉质和生长性状的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 转录因子E2F1、PLAG1、C/EBPβ和SMAD3对PLIN1基因的转录调控作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器与试剂耗材 |
| 3.2.2 启动子双荧光素酶报告载体的构建 |
| 3.2.3 细胞培养和报告载体的转染 |
| 3.2.4 转录因子的定点突变与基因干扰 |
| 3.2.5 凝胶阻滞试验(EMSA) |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PCR扩增牛PLIN1 基因启动子区域 |
| 3.3.2 重组质粒pGL3-PLIN1 Promoter的鉴定 |
| 3.3.4 双荧光素酶报告系统检测牛PLIN1基因启动子逐段缺失片段活性 |
| 3.3.5 PLIN1基因核心启动子区域关键转录因子的预测和分析 |
| 3.3.6 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 结合位点突变对PLIN1 基因启动子活性影响 |
| 3.3.7 siC/EBPβ,siE2F1,siPLAG1和siSMAD3 对各转录因子和PLIN1 基因表达量的影响 |
| 3.3.8 干扰C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 表达对PLIN1 基因的启动子活性的影响 |
| 3.3.9 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 转录因子特异结合PLIN1 基因启动子 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 牛PLIN1基因重组过表达腺病毒和干扰腺病毒包装、对牛脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要仪器与试剂耗材 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR分析 |
| 4.2.3 PLIN1基因过表达腺病毒的包装 |
| 4.2.4 PLIN1基因干扰腺病毒的包装 |
| 4.2.5 细胞免疫荧光 |
| 4.2.6 流式细胞技术分析细胞周期 |
| 4.2.7 细胞edu染色 |
| 4.2.8 蛋白质免疫印迹分析 |
| 4.2.9 油红O染色 |
| 4.2.10 甘油三酯(TG)测定 |
| 4.2.11 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 牛PLIN1 基因CDS区克隆与鉴定 |
| 4.3.2 牛PLIN1基因过表达腺病毒载体的构建与重组腺病毒包装 |
| 4.3.3 牛PLIN1基因干扰腺病毒载体的构建与重组腺病毒包装 |
| 4.3.4 PLIN1基因细胞免疫荧光 |
| 4.3.5 PLIN1基因过表达和干扰腺病毒的效率检测 |
| 4.3.6 干扰和过表达PLIN1基因对牛前体脂肪细胞增殖的影响 |
| 4.3.7 过表达和干扰PLIN1基因对牛脂肪细胞分化的影响 |
| 4.3.8 过表达和干扰PLIN1 对牛脂肪代谢相关基因的mRNA表达水平的影响 |
| 4.3.9 过表达和干扰PLIN1对牛脂肪代谢相关基因的蛋白表达水平的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 基于转录组测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要仪器设备与试剂耗材 |
| 5.2.2 牛前体脂肪细胞的分离培养及冷冻保存 |
| 5.2.3 牛前体脂肪细胞的复苏、培养及诱导分化 |
| 5.2.4 转录组测序(RNA-Seq)研究 |
| 5.2.5 实时荧光定量PCR分析 |
| 5.2.6 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 牛前体脂肪细胞总RNA质量检测 |
| 5.3.2 转录组测序数据质量评估 |
| 5.3.3 转录组测序的可变剪切(AS)事件分析 |
| 5.3.4 基因表达水平及RNA-Seq相关性分析 |
| 5.3.5 转录组差异表达基因筛选 |
| 5.3.6 转录组测序差异表达基因的RT-PCR验证 |
| 5.3.7 转录组差异基因GO富集分析 |
| 5.3.8 转录组差异基因KEGG富集分析及调控通路 |
| 5.3.9 转录组差异基因与脂类代谢相关的KEGG通路分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 秦川肉牛脂肪细胞small RNA测序及转录组测序关联分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要仪器设备与试剂耗材 |
| 6.2.2 牛前体脂肪细胞的分离培养及冷冻保存 |
| 6.2.3 牛前体脂肪细胞的复苏、培养及诱导分化 |
| 6.2.4 small RNA测序(small RNA-Seq)研究 |
| 6.2.5 small RNA测序数据处理及生物信息学分析 |
| 6.2.6 数据分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 small RNA测序结果分析 |
| 6.3.2 参考序列比对结果 |
| 6.3.3 miRNA碱基偏好性 |
| 6.3.4 已知miRNA、新mi RNA预测、ncRNA和 sRNA分类注释统计的分析 |
| 6.3.5 miRNA表达及差异分析 |
| 6.3.6 整合分析RNA-seq与 small RNA-seq |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 实验结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）间质干细胞亚群及其胞外囊泡对卵巢癌和乳腺癌影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词中英文注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 间质干细胞 |
| 1.2.1 间质干细胞生物学特性 |
| 1.2.2 间质干细胞分离培养及保存 |
| 1.2.3 间质干细胞与肿瘤 |
| 1.2.4 间质干细胞在肿瘤中的治疗潜力 |
| 1.2.5 MSCs在细胞治疗中的应用挑战 |
| 1.3 胞外囊泡 |
| 1.3.1 胞外囊泡的生物学特性与功能 |
| 1.3.2 胞外囊泡的分离、鉴定及保存 |
| 1.3.3 胞外囊泡与肿瘤 |
| 1.3.4 胞外囊泡作为肿瘤治疗物 |
| 1.3.5 间质干细胞来源胞外囊泡的特性 |
| 1.3.6 间质干细胞来源胞外囊泡与肿瘤 |
| 第二章 研究目的、方法、方案及意义 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 研究模式图 |
| 2.4 实验设计方案 |
| 2.4.1 间质干细胞的分离和鉴定 |
| 2.4.2 CB-MSCs对肿瘤细胞生物学特性的影响 |
| 2.4.3 CD90~(low) ADSCs诱导和鉴定及其对肿瘤细胞的影响 |
| 2.4.4 CD90~(low) ADSC-EVs鉴定及其对肿瘤细胞的影响 |
| 2.5 研究意义 |
| 第三章 BM-MSCS和CB-MSCS的分离培养和鉴定 |
| 3.1 试剂材料与仪器 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂和耗材 |
| 3.1.3 本课题中使用的流式抗体 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 相关溶液的配制 |
| 3.2.1 冻存液的配制(10 mL) |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 BM-MSCs分离培养及传代 |
| 3.3.2 CB-MSCs分离及培养 |
| 3.3.3 细胞的消化传代 |
| 3.3.4 细胞的冻存与复苏 |
| 3.3.5 流式细胞术分析 |
| 3.3.6 间质干细胞多向分化能力鉴定 |
| 3.3.7 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 BM-MSCs和CB-MSCs分离培养 |
| 3.4.2 BM-MSCs和CB-MSCs表面标志鉴定 |
| 3.4.3 CB-MSCs表达更高的SCA-1 和更低的CD90与BM-MSCs相比 |
| 3.4.4 BM-MSCs和CB-MSCs多向分化能力鉴定 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 CB-MSCS在卵巢癌治疗中的作用及机制 |
| 4.1 试剂材料与仪器 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂和耗材 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 相关溶液的配制 |
| 4.2.1 D-Luciferin配制 |
| 4.2.2 完全培养基DMEM或RPMI-1640 配制(500 mL) |
| 4.2.3 肿瘤组织消化液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 BM-MSCs和CB-MSCs分离及培养 |
| 4.3.2 3D培养CB-MSCs |
| 4.3.3 LPS和VIC-008 对CB-MSCs的刺激 |
| 4.3.4 RNA的提取 |
| 4.3.5 mRNA逆转录 |
| 4.3.6 实时荧光定量PCR |
| 4.3.7 肿瘤细胞培养 |
| 4.3.8 动物模型及处理 |
| 4.3.9 肿瘤生长和小鼠存活曲线 |
| 4.3.10 脾细胞的处理和体外刺激 |
| 4.3.11 ELISA |
| 4.3.12 腹水细胞和肿瘤组织的处理 |
| 4.3.13 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CB-MSCs抑制卵巢癌生长并延长小鼠生存期 |
| 4.4.2 CD90~(low) CB-MSCs中免疫激活细胞因子基因表达增加,免疫抑制细胞因子基因表达减少 |
| 4.4.3 CD90~(low) CB-MSCs联合VIC-008 进一步提高抗卵巢癌疗效 |
| 4.4.4 CB-MSCs+VIC-008 联合治疗减少了脾脏中的Treg细胞的数量,激活了CD8~+ T细胞 |
| 4.4.5 联合治疗降低了肿瘤环境中Treg细胞的数量,激活了CD8~+ T细胞 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 CD90LOW ADSCS在乳腺癌治疗中的作用研究 |
| 5.1 试剂材料与仪器 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验试剂和耗材 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 相关溶液的配制 |
| 5.2.1 完全培养基DMEM或RPMI-1640 配制(500 mL) |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 ADSCs分离及培养 |
| 5.3.2 流式细胞术分析 |
| 5.3.3 ADSCs多向分化能力鉴定 |
| 5.3.4 细胞系及培养 |
| 5.3.5 肿瘤模型及处理 |
| 5.3.6 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 ADSCs分离培养及诱导 |
| 5.4.2 流式细胞术检测分析诱导后ADSCs的表型 |
| 5.4.3 T-SNE分析ADSCs表面分子之间的联系 |
| 5.4.4 ADSCs多向分化能力鉴定 |
| 5.4.5 CD90~(low) ADSCs在体内抑制乳腺癌细胞生长 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 CD90LOW ADSCS-EVS在乳腺癌中的作用研究 |
| 6.1 试剂材料与仪器 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 实验试剂和耗材 |
| 6.1.3 实验仪器 |
| 6.2 相关溶液的配制 |
| 6.2.1 Western-blot相关试剂的配制 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 ADSCs分离及培养 |
| 6.3.2 ADSC-EVs分离及鉴定 |
| 6.3.3 透射电镜样本制备 |
| 6.3.4 扫描电镜样本制备 |
| 6.3.5 ADSC-EVs蛋白的提取 |
| 6.3.6 Western-blot |
| 6.3.7 NTA检测 |
| 6.3.8 平板克隆实验 |
| 6.3.9 划痕实验 |
| 6.3.10 Transwell |
| 6.3.11 改造ADSC-EVs及转染 |
| 6.3.12 流式细胞术分析细胞凋亡 |
| 6.3.13 肿瘤模型及处理 |
| 6.3.14 统计分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 ADSCs-EVs分离及鉴定 |
| 6.4.2 NTA检测分析ADSCs-EVs粒径 |
| 6.4.3 CD90~(low) ADSC-EVs在体外抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 6.4.4 CD90~(low) ADSC-EVs在体外抑制乳腺癌细胞迁移 |
| 6.4.5 CD90~(low) ADSC-EVs在体内抑制乳腺癌生长 |
| 6.4.6 MiR165p增强CD90~(low) ADSCs-EVs的凋亡能力 |
| 6.4.7 MiR165p增强CD90~(low) ADSCs-EVs在体内的抗乳腺癌作用 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 主要结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及获奖 |
| 一、发表论文情况 |
| 二、获奖情况 |
（9）人脂肪间充质干细胞深低温保存的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分：深低温保存前hADSCs分离纯化方法的研究 |
| (一) 消化液体积与容器容积之比对酶学法获取SVF/hADSCs产量、活细胞率及生物学特性的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| (二) 氯化铵(NH_4Cl)裂解法分离纯化hADSCs对其生物学特性的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| (三) 深低温保存NH_4Cl裂解法分离纯化hADSCs的生物学特性 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 第一部分小结 |
| 第二部分 hADSCs低温生物学参数探索:跨膜水传输与胞内冰形成的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.研究结果与讨论 |
| 3.讨论 |
| 第二部分小结 |
| 第三部分 hADSCs冷冻流程的研究 |
| (一) 降温速率对hADSCs干细胞生物学特性的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| (二) 细胞浓度对深低温保存hADSCs的生物学特性的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 第三部分小结 |
| 第四部分 纳米氧化石墨烯在脂肪干细胞深低温保存中的保护作用的研究 |
| (一) 体外实验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| (二) 体内实验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计学分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 第四部分小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 人脂肪充质干细胞的制备及低温保存研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 致谢 |
| 发表文章及学术交流 |
（10）RNA干扰介导的NUF-2基因表达下调对肝细胞癌增殖及细胞周期的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验器材 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要实验试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 技术流程图 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 细胞RNA的提取及浓度分析检测 |
| 3.4 qRT-PCR检测NUF-2 的表达 |
| 3.5 慢病毒载体的构建、包装和稳定细胞株的筛选 |
| 3.6 Western blotting检测抑制NUF-2 蛋白表达效果 |
| 3.7 Celigo法检测细胞增殖 |
| 3.8 MTT法检测细胞增殖 |
| 3.9 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 3.10 统计分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 在4 种人肝癌细胞系中NUF-2 基因的表达情况 |
| 4.2 慢病毒转染SMMC-7721 细胞的结果 |
| 4.3 慢病毒转染成功后qRT-PCR测定SMMC-7721 细胞中NUF-2 mRNA表达情况 |
| 4.4 抑制NUF-2 基因对SMMC-7721 细胞NUF-2 蛋白表达的效果 |
| 4.5 Celigo细胞荧光计数法检测细胞病毒转染对两组转染细胞增殖的影响 |
| 4.6 抑制NUF-2 基因对肝癌细胞SMMC-7721 增殖的影响 |
| 4.7 抑制NUF-2 基因对肝癌细胞SMMC-7721 细胞周期的影响 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Ndc80着丝粒复合体组件 NUF-2 的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的成果目录 |
| 致谢 |
四、一种肝细胞联合冷冻保存的新方法（论文参考文献）
- [1]白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响[D]. 冯天雨. 西北农林科技大学, 2021
- [2]LR12在TAA诱导的急性肝衰竭中的治疗作用及机制研究[D]. 王永娟. 河北医科大学, 2021(02)
- [3]二肽基肽酶-Ⅳ检测新方法的建立及其在大鼠脏器损伤评价中的比较性研究[D]. 马红. 大连医科大学, 2021
- [4]两性离子分子甜菜碱在间充质干细胞冷冻保存中的应用研究[D]. 郜磊. 天津大学, 2020(02)
- [5]人羊膜上皮细胞修复大鼠卵巢功能不全的实验研究[D]. 张玉林. 重庆医科大学, 2020(01)
- [6]鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证[D]. 韦茏芹. 广西大学, 2020(02)
- [7]牛PLIN1基因转录调控机制及其对前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢的作用研究[D]. 李世军. 西北农林科技大学, 2020
- [8]间质干细胞亚群及其胞外囊泡对卵巢癌和乳腺癌影响的研究[D]. 李涛. 江苏大学, 2020(01)
- [9]人脂肪间充质干细胞深低温保存的研究[D]. 李梓菲. 北京协和医学院, 2020(05)
- [10]RNA干扰介导的NUF-2基因表达下调对肝细胞癌增殖及细胞周期的影响[D]. 李文秀. 南华大学, 2019(01)